[发明专利]一种表皮干细胞混悬液的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了表皮干细胞混悬液的制备方法及其应用。该方法采用改良的组织贴壁法从人的包皮组织中获得表皮干细胞和表皮干细胞因子，将收获的表皮干细胞和表皮干细胞因子进行混合，获得细胞混悬液，将混悬液移植到皮肤创面，促进表皮细胞的粘附、生长、迁徙，为后期表皮干细胞发挥修复作用提供良好的微环境。

技术领域

本发明涉及一种表皮干细胞混悬液的制备方法及其应用，属于细胞培养技术领域。

背景技术

皮肤创面修复是整形科和外科最常遇到的问题之一。皮肤创面修复是一个非常复杂的生物学过程，如果皮肤创面较大，或合并糖尿病、感染、局部缺血缺氧及其他慢性疾病等将妨碍创面的正常愈合过程，从而导致创面延迟愈合甚至长期不愈合。

目前临床上常用的创面治疗方法有负压引流、生物敷料、皮片移植以及皮瓣移植等，虽然取得了一定程度的疗效，但失败率近半数。深度创伤愈合后更是缺失毛囊、皮脂腺、汗腺等皮肤附属器官，导致无法有效重建生理功能，严重影响患者的生活质量。

干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，具有高度的增殖潜能和分化潜能，还可以分泌大量的细胞因子，参与组织修复、血管再生、免疫调节、炎症反应等。表皮干细胞是成体干细胞的一种，其增殖分化维系着表皮的正常结构和生理功能，是皮肤及附属器官发生、修复的基础，也是皮肤创面修复过程中的重要种子细胞。表皮干细胞在特定诱导条件下可以诱导分化成皮肤和附属器官，研究表面在缺失表皮干细胞的情况下，上皮组织的修复进度将受到明显的影响。组织工程表皮很多年前就被应用于大面积烧伤的治疗，对提高烧伤病人的存活率起了非常关键的作用，但是一般的组织工程表皮移植到人体后有很多问题，包括表皮容易增生过度、表皮容易起水泡、不能形成完整生理功能的皮肤，因此限制了临床应用和推广。近几年组织工程皮肤应用较广泛，它包含了真皮和表皮，是在体外用培养的表皮细胞、真皮细胞和胶原蛋白合成的，临床应用于治疗创面愈合有较好的疗效。但是此类组织工程皮肤培养时间较长，需要较长时间才能形成皮肤结构，耽误了治疗时机。

目前表皮干细胞的培养方法主要有两种：一种是IV型胶原粘附法，这种方法培养的干细胞增殖较差；第二种是分选法，用免疫磁珠或者流式细胞仪进行分选，得到较高纯度的表皮干细胞，但是这种方法操作复杂，而且成本较高，不利于大规模推广。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种表皮干细胞混悬液的制备方法及其应用。该方法采用改良的组织贴壁法从人的包皮组织中获得表皮干细胞和表皮干细胞因子，将收获的表皮干细胞和表皮干细胞因子进行混合，获得细胞混悬液，将混悬液移植到皮肤创面，促进表皮细胞的粘附、生长、迁徙，为后期表皮干细胞发挥修复作用提供良好的微环境。

一种表皮干细胞混悬液的制备方法，包括如下步骤：

(1)采集包皮组织，使用含抗生素的缓冲液处理后将组织切成小块，加入Disapase酶溶液消化60-120min，消化后的组织将真皮和表皮分开；

(2)将步骤(1)获得的表皮组织切碎后接种到预先用Coating Matrix处理过的培养皿中，放入培养箱中过夜；次日在上述培养皿中加入表皮干细胞培养基继续培养，当细胞融合度达到70～80％进行传代培养，传到P3代细胞；

(3)步骤(2)获得的P3代细胞继续传代培养P4代细胞，当P4代细胞的融合度达到70-80％时收取培养液的上清液A，将上清液A离心，收集上清液B，将上清液B浓缩100过倍后过滤除菌，即可获得表皮干细胞因子；

(4)步骤(3)获得的P4代细胞消化，离心，收获表皮干细胞悬液；

(5)将步骤(3)获得的表皮干细胞因子和步骤(4)中获得表皮干细胞培养液混合，获得表皮干细胞混悬液。