[发明专利]一种表皮干细胞混悬液的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种表皮干细胞混悬液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采集包皮组织，使用含抗生素的缓冲液处理后将组织切成小块，加入Disapase酶溶液消化60-120min，消化后的组织将真皮和表皮分开；

(2)将步骤(1)获得的表皮组织切碎后接种到预先用Coating Matrix处理过的培养皿中，放入培养箱中过夜；次日在上述培养皿中加入表皮干细胞培养基继续培养，当细胞融合度达到70～80％进行传代培养，传到P3代细胞；

(3)步骤(2)获得的P3代细胞继续传代培养P4代细胞，当P4代细胞的融合度达到70-80％时收取培养液的上清液A，将上清液A离心，收集上清液B，将上清液B浓缩100过倍后过滤除菌，即可获得表皮干细胞因子；

(4)步骤(3)获得的P4代细胞消化，离心，收获表皮干细胞悬液；

(5)将步骤(3)获得的表皮干细胞因子和步骤(4)中获得表皮干细胞培养液混合，获得表皮干细胞混悬液。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述表皮干细胞培养基为添加牛垂体提取物、胰岛素、纤维母细胞因子、维生素C、转铁蛋白、青霉素、链霉素的K-SFM角质培养基。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的抗生素为青霉素-链霉素、两性霉素B或庆大霉素的一种；所述缓冲液为pH7.4的磷酸盐缓冲液、注射用生理盐水或D-Hank’s液的一种。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的Disapase酶溶液的浓度为2.5mg/mL。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述培养箱的培养条件为36-37℃、4.5-5％CO₂。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的传代培养指表皮干细胞按照2-3×10⁴/cm²的密度传代。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的完全培养基指含抗生素、10～15％胎牛血清的DME/F12，DMEM，高糖DMEM，α-MEM的其中一种。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述的表皮干细胞因子终浓度为25-50μg/ml。

9.利用如权利要求1-8任一项所述制备方法制备的表皮干细胞混悬液。

10.如权利要求1-8任一项所述制备方法制备的表皮干细胞混悬液在皮肤创伤愈合中的应用。