[发明专利]单碱基连续延伸流式靶向测序法

说明书

本发明公开了一种单碱基连续延伸流式靶向测序法，该方法利用含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段、引物、微球、核酸聚合酶、荧光标记的ddNTP、核糖3'‑OH被保护的荧光标记的dNTP、核糖3'‑OH被保护的dNTP、核糖3'‑OH去保护剂等，通过引物的单碱基延伸，得到了一系列适用于流式细胞仪检测核酸碱基序列的测序微球，将这些测序微球进一步经流式细胞仪进行检测，可以得到待测核酸片段的碱基序列。与现有测序法相比，本发明具有简洁、准确及数据易解读等显著优点，能广泛用于基因检测、微生物检查、遗传学、外显子、单核苷酸多态性(SNP)、基因组学和蛋白质组学等核酸测序领域。

技术领域

本发明涉及一种单碱基连续延伸流式靶向测序法，尤其涉及一种适用于流式细胞仪检测的测序微球的制备方法以及采用该测序微球检测核酸碱基序列的方法，属于基因测序技术领域。

背景技术

基因组携带了生命个体的全部遗传信息，基因测序不但能够加深对疾病尤其是恶性肿瘤的分子机制理解，而且在指导靶向给药方面也发挥着重要作用。人类基因组学计划完成后，基因测序技术的发展更加迅猛，在临床实践和基础研究中的应用更加广泛。目前，核酸测序法已发展至三代，从最初第一代以Sanger测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到2005年以illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二代测序（next-generation sequencing，NGS），到以SMRT、Nanopore法为代表的第三代测序，这些测序法虽然在不断地提高基因测序的效率和准确性，但仍然存在操作复杂和数据不易解读(如：基因结构重排和重复区域)等问题，制约了其大规模临床应用。

流式细胞技术是利用流式细胞仪对单个细胞或颗粒进行多参数、快速的定量分析的技术，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是先进的生物传感技术之一。已有基于引物或探针包被微球的流式细胞分析只能用于单碱基和核苷酸片段的识别，而不能用于碱基测序。因此发展一种适用于流式细胞仪的单碱基连续延伸流式靶向测序法具有重大价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于流式细胞仪检测核酸碱基序列的单碱基连续延伸流式靶向测序法，该方法通过制备针对待测核酸序列的测序微球，再以流式细胞仪检测该测序微球，可以准确地识别待测核酸片段的碱基序列。

目前，基因检测在遗传学、产前诊断、及伴随诊断等医学领域中有重要的应用。例如：通过基因检测确定患者特定基因片段的突变位点，能够指导靶向给药，提高肿瘤的治疗效果。而现有流式细胞技术仅能对单个碱基和寡核苷酸片段进行识别，而不能用于碱基测序。本发明提供了适用于流式细胞仪进行核酸测序的单碱基连续延伸流式靶向测序法，利用该方法制备测序微球并用流式细胞仪检测测序微球，能够得到具体的核酸碱基序列，进而可以解读基因突变的信息，对发病机理阐述、患病个体诊治都有重要意义。

本发明的技术方案如下：

一种单碱基连续延伸流式靶向测序法，该方法包括以下步骤：

(1)将引导待测核酸片段合成的修饰单向引物或含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段包被在微球表面，得包被微球；

(2)将包被微球、含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段或引导待测核酸片段合成的修饰单向引物（简称单向引物或修饰单向引物，下同）、缓冲液混合，所得混合物进行孵育杂交；

(3)缓冲液洗涤、悬浮微球，将微球分为两份，其中一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP（deoxynucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸）混合，所得混合物进行孵育；另一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、荧光标记的ddNTP（dideoxynucleoside triphosphate，双脱氧核苷三磷酸）或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP混合，所得混合物进行孵育；

(4)将上一步与核糖3'-OH被保护的dNTP混合后进行孵育的微球进行洗涤，再加入核糖3'-OH去保护剂，混合均匀；