[发明专利]单碱基连续延伸流式靶向测序法

权利要求书

1.单碱基连续延伸流式靶向测序法，其特征是包括以下步骤：

(1)将引导待测核酸片段合成的修饰单向引物或含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段包被在微球表面，得包被微球；

(2)将包被微球、含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段或引导待测核酸片段合成的修饰单向引物、缓冲液混合，所得混合物进行孵育杂交；

(3)缓冲液洗涤、悬浮微球，将微球分为两份，其中一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP混合，所得混合物进行孵育；另一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP混合，所得混合物进行孵育；

(4)将上一步与核糖3'-OH被保护的dNTP混合后进行孵育的微球进行洗涤，再加入核糖3'-OH去保护剂，混合均匀；

(5)缓冲液洗涤、悬浮上一步的微球，将微球分为两份，其中一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP混合，所得混合物进行孵育；另一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP混合，所得混合物进行孵育；

(6)不断重复上述（4）和（5）的步骤，测序待测核酸片段n个碱基共需连续制备n群微球，共得到与荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP混合后进行孵育的n群微球；

(7)如果利用上述步骤（6）的n群微球无法检测出所有的碱基，则替换步骤（3）和（5）的荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，更换容器，采用步骤（2）-（6）继续制备微球，共得到4×n或2×n群微球；

(8)将步骤（6）和（7）中得到的4×n、或2×n、或n群微球洗涤、悬浮后，上样流式细胞仪进行检测，即可得到待测核酸片段的碱基序列；

所述荧光标记的ddNTP为荧光标记的ddATP、ddGTP、ddCTP和ddUTP/ddTTP中的至少一种；

所述核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP为核糖3'-OH被保护的荧光标记的dATP、dGTP、dCTP和dUTP/dTTP中的至少一种；

所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、dTTP/dUTP、dGTP和dCTP的混合物；

微球上包被的是引导待测核酸片段合成的修饰单向引物时，步骤（2）中加入的是含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段；微球上包被的是含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段时，步骤（2）中加入的是引导待测核酸片段合成的修饰单向引物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP被下述任意一种或多种的荧光物质进行标记：异硫氰酸荧光素、AlexaFluor 610、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 700、菁染料Cy5、德克萨斯红、菁染料Cy3、菁染料Cy7、羟基荧光素、萤光黄、菁染料Cy5.5、罗丹明110、ROX、罗丹明6G、TAMRA。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：步骤（3）和（5）中加入任意两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，得到n群微球，然后将步骤（3）和（5）中的两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP替换为另两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，更换容器，采用步骤（2）-（6），得到n群微球，共得2n群微球。