[发明专利]一种人体细胞外泌体工业化制备方法、质量研究及应用

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种优化的从胎儿附属物（脐血、脐带、胎盘等）、毛囊、脂肪和牙髓、跟腱等中分离培养间充质干细胞（MSC）；3D培养间充质干细胞；从人外周血和脐血中分离制备DC、CIK、NK、TCM、TSCM，CAT‑T、TCR‑T、UCART、TIL、Treg等免疫细胞；从诱导多能干细胞和胚胎干细胞中分离制备外泌体的方法及应用。本发明使用浓缩和差速离心法结合从细胞上清液中提取外泌体，优化并建立了外泌体工艺和质量标准，提高了产量，为其实现工业化生产应用创造了条件。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种优化的从胎儿附属物（脐血、脐带、胎盘等）、毛囊、脂肪和牙髓、跟腱等中分离培养间充质干细胞（MSC）；3D培养间充质干细胞；从人外周血和脐血中分离制备DC、CIK、NK、TCM、TSCM，CAT-T、TCR-T、UCART、TIL、Treg等免疫细胞；从诱导多能干细胞和胚胎干细胞中分离制备外泌体的方法及应用。

背景技术

人间充质干细胞(human MSCs, hMSCs)是一类具有一定的自我复制更新和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于胎儿和成人各组织中，如骨髓、脂肪、皮肤、牙髓、肌腱，以及新生儿附属组织，如脐带、胎盘、羊膜等等组织。除一定程度的分化潜能外，hMSCs还具有独特的免疫调控和组织再生功能，参与调控异常免疫反应、维护免疫平衡，帮助机体形成有利于病损组织细胞修复或再生的微环境，以促进损伤组织细胞的修复或再生，但其发挥作用的机制目前还不明确，最初认为脐带间充质干细胞植入人体后归巢到受损部位，进行细胞自我更新和定向分化，但后续研究表明移植的细胞大部分发生了凋亡，归巢到损伤部位的细胞和分化为靶细胞的数量有限，不能充分解释其组织修复现象，现在越来越多的研究认为脐带间充质干细胞是通过旁分泌机制分泌大量的细胞因子作用于受损部位，进而促进组织修复。

外泌体是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程形成的直径40-100 nm的膜性脂质小囊泡，其内含有功能性蛋白质、mRNA及microRNA等物质，在细胞间的信息传递过程中发挥重要作用，广泛参与机体损伤组织修复、基因交换、抗原呈递免疫反应、肿瘤转移等生理病理过程。外泌体可通过配体-受体相互作用的方式粘附到受体细胞表面，亦可通过受体细胞内吞摄取或通过囊泡和细胞膜的直接融合使外泌体内容物释放到靶细胞内，发挥细胞间的通讯作用，从而调节靶细胞的生物学行为。与细胞相比，细胞分泌的外泌体更稳定，更安全，保存更方便，质量更好控制，有望成为一种新的治疗方法。

目前提取外泌体的方法主要有超高速离心法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、试剂盒法、色谱法等，难以工业化生产，研究一种高效的，可以工业化生产的，高纯度的细胞外泌体的制备方法尤为重要。

发明内容

使用浓缩和差速离心法结合从细胞上清液中提取外泌体，应用电镜NanoSight粒径分析、Western Blotblot方法对细胞上清液来源外泌体的生物学特性进行检测与分析，并对外泌体工业化生产工艺进行质量控制。

本发明是通过以下步骤得到的：

1.人体细胞来源外泌体的制备：

用本人发明的MSC培养试剂盒（申请号2019107271592）培养人脐带间充质干细胞，血清培养体系下细胞的融合度达到70-80％时更换为无血清培养基继续培养24-48h，收集培养上清液；

2．超滤法：

（1）收集细胞上清液分装至50ml离心管，1500rpm，10min；

（2）离心结束后，用20ml注射器吸取上清，用0.45μm 针头滤器过滤；

（3）取新的20ml注射器吸取过滤后的液体，用0.22μm 针头滤器过滤；

（4）过滤液加入超滤管内，3000g、15min；

（5）离心结束后，去除外管液体，并往内管添加过滤液，3000g，根据情况调整离心时间，单次不超过2H，直到理想浓度体积；

（6）收集内管的浓缩液并转移至新的15ml离心管，-80℃冻存备用。