[发明专利]一种人体细胞外泌体工业化制备方法、质量研究及应用

权利要求书

1.一种优化的从胎儿附属物（脐血、脐带、胎盘等）、毛囊、脂肪和牙髓、跟腱等中分离培养间充质干细胞（MSC）；3D培养间充质干细胞；从人外周血和脐血中分离制备DC、CIK、NK、TCM、TSCM，CAT-T、TCR-T、UCART、TIL、Treg等免疫细胞；从诱导多能干细胞和胚胎干细胞中分离制备外泌体的方法及应用：

（1）人体细胞来源外泌体的制备：

用本人发明的MSC培养试剂盒（申请号2019107271592）培养人脐带间充质干细胞，血清培养体系下细胞的融合度达到70-80％时更换为无血清培养基继续培养24-48h，收集培养上清液；

（2）超滤法：

1）收集细胞上清液分装至50ml离心管，1500rpm，10min；

2）离心结束后，用20ml注射器吸取上清，用0.45μm 针头滤器过滤；

3）取新的20ml注射器吸取过滤后的液体，用0.22μm 针头滤器过滤；

4）过滤液加入超滤管内，3000g、15min；

5）离心结束后，去除外管液体，并往内管添加过滤液，3000g，根据情况调整离心时间，单次不超过2H，直到理想浓度体积；

6）收集内管的浓缩液并转移至新的15ml离心管，-80℃冻存备用；

（3）超速离心法：

1）收集浓缩液分装至50ml离心管；

2）300g离心10min，去除完整细胞；

3）2000g离心20min，进一步去除死细胞和杂质；

4）10000g离心30min，去除细胞碎片；

5）100000g离心70min，弃上清，沉淀用50ul PBS重悬；

（4）外泌体质量控制

电镜NanoSigh粒径分析显示，外泌体呈典型的杯状结构且粒径大小主要为100nm左右；将获得的外泌体蛋白抽提后进行Western Blotblot检测，其表达外泌体特异性蛋白Alix,CD63及CD9；内毒素检测阴性、真细菌、支原体、细胞内、外病毒因子检测、细胞因子残留量、BSA残留量和抗生素残留量合格。

2.应用权利要求1所述的人脐带MSC来源外泌体工业化生产和质量控制标准其特征在于，包括以下步骤：

脐带间充质干细胞的分离和培养方法：

MSC细胞培养添加剂MSC-配置，其中含有2-50ng/mL bFGF和2-50ng/ml EGF；

配置完全培养液的配制：MSC- 中添加1/1000 MSC-、2mM GlutaMAX™-I和10%Prime FBS，取10ml包被150cm培养皿；

用尖头直剪将脐带剪成约2cm长度的小段，至少清洗3次，取最后一次清洗液20ml做菌检；

转移脐带组织至一新的培养皿中，将脐带一端沿静脉腔内剪个切口，用组织镊沿切口方向静脉血管边缘纵向撕开，用组织镊去除羊膜，小心地将1根静脉血管和2根动脉血管剖离，翻转脐带，撕去上皮，得到的华通氏胶用手术刀切成边长 3-5mm 之间的小块，将 3-5mm之间的组织小块均匀的种植在150cm培养皿中，组织块之间的间距为 1cm左右，放入培养箱中，48H后补液至30ml，至第七天静止不动；

第七天全量换液，经过11-15天的原代培养，收获原代MSC细胞，P0细胞数量达到约1x10⁷，P0传P1代，细胞扩增倍数不应低于7倍，低于7倍说明原代细胞有老化现象；

细胞分为种子细胞库和工作细胞库二级库，传至P2代时收获种子细胞，内毒素和流式表型检测合格后入种子细胞库；

传代培养至P5代工作细胞入待检区，待细胞数量、活性、表型、内毒素、真细菌、支原体、STR分型检测、核型分析、细胞内、外病毒因子检测和诱导分化能力检测合格后入工作细胞库；

每次细胞传代前24-48小时换成无血清培养基，传代和收获后收集无血清细胞上清液，用于制备外泌体。

3.应用权利要求2所述的人脐带间充质干细胞为P1-P10代培养的间充质干细胞。

4.应用权利要求2所述的人脐带间充质干细胞，细胞汇合度达到70%-80%时更换为无血清培养基，24-48H后收集无血清细胞上清液；上清液浓缩倍数为2-100倍。