[发明专利]用于小麦外显子测序基因定位的探针设计方法及定位方法

说明书

本发明涉及小麦功能基因定位技术领域，特别是涉及用于小麦外显子测序基因定位的探针设计方法，通过高通量测序平台进行测序获得转录组数据后与比对参考基因组进行比对分析，再进行转录本拼接、合并，再进行ORF预测，去掉重复区域的序列，将筛选的序列进行高密度探针合成，即得。基因定位方法包括：将小麦DNA打断成片段，再将打断后的小麦DNA与上述高密度探针进行杂交，磁珠富集后洗脱，再进行高通量测序、变异检测、统计定位即可。本发明解决现有技术中因小麦基因组庞大导致基因定位成本高昂的问题，通过设计超高密度多重引物探针，只针对于基因外显子序列进行测序，在同样的基因测序深度情况下，减少了80％的测序成本。

技术领域

本发明涉及小麦功能基因定位技术领域，特别是涉及用于小麦外显子测序基因定位的探针设计方法及定位方法。

背景技术

现有小麦全基因组测序BSA-seq，是对小麦基因组整体进行测序检测，由于小麦基因组十分庞大，成本太高。

现有小麦转录组测序BSR-seq使用的是基因表达的数据进行检测，受到样本组织、样本时期、环境等因素的影响，有非常大的数据偏好，基因表达数据本身不是遗传信息，具有一定的假阳性。

现有SNP芯片无法获取基因的序列信息且SNP密度相对低，SNP芯片只能分析突变信号，无法获取到材料、样本的序列信息。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于小麦外显子测序基因定位的探针设计方法，用于解决现有技术中小麦基因组庞大导致使用全基因测序BSA-seq手段获得基因信息成本高昂的问题，同时，本发明还将提供一种小麦外显子测序基因定位方法。本发明中的一种用于小麦外显子测序基因定位的探针设计方法通过设计超高密度多重引物探针，在全基因组DNA水平对小麦基因组超过16万个基因外显子进行特异性捕获，只针对于基因外显子序列进行测序，在同样的基因测序深度情况下，减少了80％以上的测序成本，小麦基因组15GB大小，全基因重测序30倍覆盖需要450G数据量，该方法仅需对300M区段进行测序，100倍覆盖需要数据量30G数据量。

为实现上述目的及其他相关目的，

本发明的第一方面，提供一种用于小麦外显子测序基因定位的探针设计方法，包括如下步骤：

步骤一、通过大规模转录组测序数据选取不同的组织、环境、发育等数据，再通过高通量测序平台进行测序，得到测序数据待用；

步骤二、通过STAR软件对测序数据与比对参考基因组进行比对分析，再通过stringtie函数进行转录本拼接，并过滤基因表达量TPM(转录本表达量Transcripts PerKilobase Million)小于2的转录本，保留基因表达量TPM≥2的转录本待用；

步骤三、将步骤二中的转录本与IWGSC CS Annotation转录本进行合并，得到合并后的转录本待用；

步骤四、通过TransDecoder(v5.5.0)对步骤三中合并后的转录本进行ORF(开放式阅读框Open Reading Frame)预测，再通过bedtools软件合并ORF预测出的CDS(编码区coding sequence)区域，再使用kmer算法扫描合并后的CDS序列，分析重复及重叠的区域，去掉N及Repeat区域的序列，得到筛选的序列；

步骤五、将步骤四中筛选的序列进行高密度探针合成，即得用于小麦外显子测序基因定位的探针。

上述探针设计方法通过设计超高密度多重引物探针，在全基因组DNA水平对小麦基因组超过16万个基因外显子进行特异性捕获，只针对于基因外显子序列进行测序，在同样的基因测序深度情况下，减少了80％的测序成本。

步骤二中比对参考基因组具体为IWGSC RefSeq(https://www.wheatgenome.org/)。