[发明专利]高CG片段与低CG启动子联用构建高效表达载体的方法

说明书

本发明公开了一种高CG片段与低CG含量的启动子联用构建高效表达载体的方法，所述方法选择含增强子且在转录起始位点上游CG含量＜50%的启动子为靶启动子；用所述靶启动子替换商业载体pEGFP‑C1上的外源基因表达框中CMV启动子，构建中间载体；在所述中间载体的外源基因表达框之前Ase I酶切位点插入1‑1.5kb的CG含量＞70%的CG片段U1，构建表达载体；所述表达载体经验证能使靶启动子表达框内的EGFP基因表达量持续稳定高效表达。本发明所述方法可以应用于抗体及蛋白药物的工业化生产领域或基因治疗，以提高生产效率，降低生产成本，或经进一步改进后应用于该领域。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及用于重组抗体或蛋白药物生产等的表达载体及其构建方法，尤其涉及一种高CG序列与低CG含量的弱启动子联用构建高效表达载体的方法。

背景技术

重组治疗性抗体、疫苗或蛋白药物（统称重组药）是重大疾病如癌症、类风湿关节炎、乙型肝炎和艾滋病等疾病的有效药物，这些重组药应用于市场主要存在的问题是研发和生产成本高，导致药品价格昂贵，因此降低研发和生产成本是重组药生产的迫切需求。

重组药细胞株筛选的复杂性和生产过程中表达量下降即生产细胞株不稳定的现象，是研发和生产中的主要障碍，其关键环节在于构建稳定高效表达载体。表达载体在不同的细胞系中因整合位置和表观遗传因素引起的转基因沉默是影响重组药稳定高产的主要原因。其中表观遗传机制导致的生产不稳定尤其复杂和难以捉摸，这些表观因素包括组蛋白修饰(低乙酰化)、DNA甲基化和染色质重塑等。这些表观修饰最终将以宏观的染色质开放状态表现出来，因此在染色质开放状态层面调控和评价转基因沉默及应对方案，是从整体水平解决和应对转基因沉默的技术方案。

高CG片段（CG含量70%）如遍在染色质开放元件（ubiquitous chromatin openingelements，UCOE）(Antoniou，et al,2003)可建立和维持转录专一的开放染色质结构。UCOE序列在与某些启动子结合时，具有克服转基因沉默的效应。然而，在实践中，因为UCOE序列并非与所有不同类型的启动子结合都能有效激活基因表达，有些启动子与UCOE序列结合对下游基因的改变很小，有些则改变较大产生较好的激活效应，可它们之间的结合规律并不清楚。

通过对真核生物的启动子特征进行分析，发现在TSS（转录起始位点）附近存在许多顺式作用元件如TATA box、增强子和CpG岛（CG含量＞60%）参与染色质的表观调节，这些元件是主动调节关联启动子区域染色质重塑的DNA序列，其中CpG岛尤其重要。依据启动子上的CpG岛把启动子分为含CpG岛或高CG含量的启动子和低CG含量的启动子两种类型（Wang, B., J. Sun, et al. (2016). Small-Activating RNA Can Change NucleosomePositioning in Human Fibroblasts. Journal of Biomolecular Screening 21(6):634-642；Wangbin, Hu Yunzhang (2017). Promoter-targeted small activated RNAsalter nucleosome positioning, , RNA activation, Springer Nature, Chapter 6.）。

由于人类基因中80%的启动子都富含CG或CpG岛，因此，启动子上的CG片段/CpG岛已成为表观沉默研究的焦点。CpG岛会有选择性地募集大量染色质，CpG岛区染色质常常形成半胱氨酸甲基化缺失、低水平的组蛋白H1、高水平的组蛋白乙酰化及等无核小体区域的DNaseI的高敏感性位点。通常情况下，高表达能力的强启动子都富含CG或包含CpG岛，因此，现有技术中用高GC片段调控启动子提高其启动表达能力时，所用的启动子往往富含CG或包含CpG岛。对此，本发明提出了一种与现有技术不同的构建高效表达载体的方法，即采用高GC片段与CG含量低的启动子联用构建高效表达载体的方法。

发明内容