[发明专利]用于C-kit基因突变检测的引物组合及其应用

说明书

本发明涉及用于C‑kit基因突变检测的引物组合及其应用。本发明分别设计了C‑kit第9号外显子(C‑kit‑E9)、第11号外显子(C‑kit‑E11)、第13号外显子(C‑kit‑E13)、第17号外显子(C‑kit‑E17)、第18号外显子(C‑kit‑E18)的野生型引物和突变型引物，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段，不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法进行区分；与现有技术相比，本发明具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及用于C-kit基因突变检测的引物组合及其应用。

背景技术

C-kit基因位于人染色体4q12-13，属于原癌基因，编码跨膜糖蛋白-酪氨酸激酶受体。C-KIT是酪氨酸激酶受体蛋白家族的重要成员之一，其作为干细胞因子的受体，受干细胞因子激活后调节基因表达、控制细胞生长、增殖和分化。C-kit基因的突变可能与肿瘤的产生有一些关联。

胃肠道间质瘤(GIST)是消化道最常见的间叶源性肿瘤。绝大部分的GIST均表达C-kit基因编码的Kit蛋白(CD117)。在分子层面上，大部分的GIST均存在C-kit基因突变，从而导致Kit蛋白的活化不需要配体SCF参与就能刺激肿瘤细胞的持续增殖和抗凋亡信号的失控。

GIST中C-kit基因突变率约为90％，且突变形式多样。其中位于11号外显子Lys550-Val560区段的变异最为常见(约占70-80％)，位于9号外显子Ala502-Tyr503区段的6碱基重复突变约占5-10％。

格列卫(Glivec)是一种酪氨酸激酶抑制剂，经FDA批准可用于治疗C-kit阳性、不能手术切除和/或转移性的恶性GIST，其临床疗效令人振奋。其作用机理在于药物结合于Kit蛋白胞浆内酪氨酸激酶功能区的ATP结合位点，阻断磷酸基团由ATP向底物酪氨酸残基的转移，从而抑制细胞增殖并恢复细胞凋亡程序。

临床研究表明GIST中C-kit基因的突变情况与格列卫分子靶向治疗的疗效相关：存在11号外显子突变患者的疗效最好，存在9号外显子突变的患者疗效次之，而野生型GIST的疗效最差。另外，对于9号外显子突变的患者，提高用药剂量可显著提高疗效。检测C-kit基因突变对于指导GIST患者的合理用药，具有重要的参考价值。

C-kit基因这些位点的突变可能与很多肿瘤的发生发展相关，包括胃肠道间质瘤、肥大细胞病、急性髓性白血病等，这些位点上的突变是细胞恶性转化及可能的肿瘤产生的预兆，应引起高度重视。因此，关于C-kit基因这些位点突变的检测有着非常重要的作用。

众所周知，高分辨熔解曲线(high-resolution melt，HRM)分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的PCR技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR(Polymerase ChainReaction)即聚合酶链式反应结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、配型等的分析。因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。然而，高分辨率熔解曲线(HRM)是传统的熔解曲线分析的延伸，它要求特殊的荧光染料、高性能的荧光定量PCR与专门的分析算法；使我们可以不必测序直接筛查PCR扩增产物中是否存在遗传学变异(SNPs,mutations)。SYBR^TM Green I对PCR扩增有毒性，因此必需使用低浓度的染料，又因为它是非饱和态结合，染料在熔解过程中可重新结合，使其无法适用于HRM。