[发明专利]载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法

说明书

本发明属于胰腺癌研究技术领域，尤其是载脂蛋白AI模拟肽L‑4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，针对抑制胰腺癌发展研究方法成本高效果不明显的问题，现提出以下方案，包括以下步骤，小鼠模型建立：C57BL/6小鼠术前禁食24小时，不禁水；2％戊巴比妥钠(1.5mL/kg体重)腹腔内注入麻醉，每组动物均经上腹正中切口1.5cm进腹，胰腺癌模型组在暴露胰腺后，于胰体尾部以1mL注射器注射置入载脂蛋白AI模拟肽L‑4F悬液在普通环境饲养；在3‑5个月期间随时观察小鼠精神状况，体重以及有无腹水。本发明小鼠模型建立更加稳定，节约了研究成本，并且观察更直观，多参数实验，提高了实验研究的精确度。

技术领域

本发明涉及胰腺癌研究技术领域，尤其涉及载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法。

背景技术

胰腺癌临床表现取决于癌的部位、病程早晚、有无转移以及邻近器官累及的情况。其临床特点是整个病程短、病情发展快和迅速恶化。最多见的是上腹部饱胀不适、疼痛。虽然有自觉痛，但并不是所有病人都有压痛，如果有压痛则和自觉痛的部位是一致的。

现有的科学研究中，经常需要进行抑制胰腺癌干细胞干性特征，但现有的方法在操作方便性、成本、效果等方面存在不理想。

经检索，中国专利申请号为201310027873.7的专利，公开了一种miR-200a抑制胰腺癌干细胞干性特征的方法，包括人胰腺癌细胞系PANC-l培养、流式细胞仪检测和分选胰腺癌干细胞、无血清悬浮培养PANC-l干细胞球细胞、过表达miR-200a。上述专利中的一种miR-200a抑制胰腺癌干细胞干性特征的方法存在以下不足：该方法不便于胰腺癌的研究，而常规的胰腺癌研究多采用白鼠实验的方式，该方法不能灵活观测胰腺癌的发展状况。

发明内容

基于抑制胰腺癌发展研究方法成本高效果不明显的技术问题，本发明提出了载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法。

本发明提出的载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，包括以下步骤：

S1：小鼠模型建立：C57BL/6小鼠术前禁食24小时，不禁水；2％戊巴比妥钠(1.5mL/kg体重)腹腔内注入麻醉，每组动物均经上腹正中切口1.5cm进腹，胰腺癌模型组在暴露胰腺后，于胰体尾部以1mL注射器注射置入载脂蛋白AI模拟肽L-4F悬液在普通环境饲养；在3-5个月期间随时观察小鼠精神状况，体重以及有无腹水，对照组仅进行胰体尾部以1mL注射器注射至于等量的生理盐水；

S2：巨检：处死小鼠，开腹剥离肿瘤，记录质地、浸润、血清情况、观察有无腹腔粘连，各脏器转移状况，将手术切除的部分新鲜肿瘤组织立即放入含有庆大霉素的1％小牛血清RPM1640培养液10mL的小瓶内待用，部分肿瘤组织置于10％的福尔马林固定液中待用；

S3：病理学检测：S2中产生的标本使用常规福尔马林固定，石蜡包埋，4μm连续切片3张，一张行HE染色用，另外两张行免疫组化染色用；

S4：将诱导出的癌组织标本用Hanks液反复漂洗，剪成糊状，100目铜丝网过滤成无菌细胞悬液，经过不连续密度梯度离心，收用集肿瘤细胞，用Hanks液洗涤2次，用含有10％小牛血清的RPMI1640培养液制成肿瘤细胞悬液，调整细胞浓度到1X10⁶/mL；0.2mL接种C57BL/6小鼠左腋皮下，第14d处死动物，成瘤大小15-20mm₂；连续传代2代，模型建立比较稳定；

S5：肿瘤组织的双荧光染色鉴定：将爬片的肿瘤组织与DiLemma标记的乙酰化低密度脂蛋白于37℃孵育两小时，然后用多聚甲醛固定于细胞，5min后用PBS浸洗，然后再加入FITC标记的荆豆凝集素10mg/L于37摄氏度孵育一小时，PBS洗去多余染料后，中性甘油封片，用荧光显微镜或激光共聚焦观察，显示黄色荧光的为DiL-Ac-LDL阳性，显示绿色荧光的为FITC-UEA-I阳性，两者双染色阳性细胞被认为是正在分化的肿瘤组织；