[发明专利]载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法

权利要求书

1.载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：小鼠模型建立：C57BL/6小鼠术前禁食24小时，不禁水；2％戊巴比妥钠(1.5mL/kg体重)腹腔内注入麻醉，每组动物均经上腹正中切口1.5cm进腹，胰腺癌模型组在暴露胰腺后，于胰体尾部以1mL注射器注射置入载脂蛋白AI模拟肽L-4F悬液在普通环境饲养；在3-5个月期间随时观察小鼠精神状况，体重以及有无腹水，对照组仅进行胰体尾部以1mL注射器注射至于等量的生理盐水；

S2：巨检：处死小鼠胡，开腹剥离肿瘤，记录质地、浸润、血清情况、观察有无腹腔粘连，各脏器转移状况，将手术切除的部分新鲜肿瘤组织立即放入含有庆大霉素的1％小牛血清RPM1640培养液10mL的小瓶内待用，部分肿瘤组织置于10％的福尔马林固定液中待用；

S3：病理学检测：S2中产生的标本使用常规福尔马林固定，石蜡包埋，4μm连续切片3张，一张行HE染色用，另外两张行免疫组化染色用；

S4：将诱导出的癌组织标本用Hanks液反复漂洗，剪成糊状，100目铜丝网过滤成无菌细胞悬液，经过不连续密度梯度离心，收用集肿瘤细胞，用Hanks液洗涤2次，用含有10％小牛血清的RPMI1640培养液制成肿瘤细胞悬液，调整细胞浓度到1X10⁶/mL；0.2mL接种C57BL/6小鼠左腋皮下，第14d处死动物，成瘤大小15-20mm₂；连续传代2代，模型建立比较稳定；

S5：肿瘤组织的双荧光染色鉴定：将爬片的肿瘤组织与DiLemma标记的乙酰化低密度脂蛋白于37℃孵育两小时，然后用多聚甲醛固定于细胞，5min后用PBS浸洗，然后再加入FITC标记的荆豆凝集素10mg/L于37摄氏度孵育一小时，PBS洗去多余染料后，中性甘油封片，用荧光显微镜或激光共聚焦观察，显示黄色荧光的为DiL-Ac-LDL阳性，显示绿色荧光的为FITC-UEA-I阳性，两者双染色阳性细胞被认为是正在分化的肿瘤组织；

S6：肿瘤单细胞悬液的制备和培养：肿瘤组织培养七天后，用0.25％胰酶消化细胞制成细胞悬液，以同等数量细胞接种于孔板中，实验前将含10％血清的ECM-2MV培养基换为不含血清的M199培养基，随机分组，正常对照组，常规培养；

S7：活力检测：将细胞以同等数量(1X10⁴)接种于96孔板中，按实验分组处理细胞后，每孔加入20μLMTT(5g/L)，于细胞培养箱中继续培养，4h后弃去上清，每孔加入DMSO200μL，摇床振荡摇匀10min，于波长490nm处测定各孔吸光度，以对照组细胞活力为100％，其余各组细胞活力值占对照组活力值的百分比表示。

2.根据权利要求1所述的载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，其特征在于，所述S1步骤中注射深度均为2mm。

3.根据权利要求1所述的载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，其特征在于，所述S3中载玻片用APES进行防脱片处理。

4.根据权利要求1所述的载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，其特征在于，所述DiLemma标记的乙酰化低密度脂蛋白的份量为2.5g/L。

5.根据权利要求1所述的载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，其特征在于，所述多聚甲醛的份量为1％-2％。

6.根据权利要求1所述的载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，其特征在于，所述S6步骤中随机分组分为L-4F组、H₂O₂组、L-4F+H₂O₂组和LY294002+L-4F+H₂O₂。

7.根据权利要求6所述的载脂蛋白AI模拟肽L-4F抑制小鼠胰腺癌发展的方法，其特征在于，所述L-4F组：培养基中分别为10、25、50、75和100mm/L的L-4F组二十四小时。