[发明专利]埃博拉病毒感染细胞模型的制备与应用

说明书

本发明公开了埃博拉病毒感染细胞模型的制备与应用。本发明公开的埃博拉病毒感染细胞模型的制备方法，包括：1)利用Ebola trVLP系统获得埃博拉转录复制相关病毒样颗粒；2)利用埃博拉转录复制相关病毒样颗粒感染重组细胞，获得埃博拉病毒感染细胞模型；重组细胞为含有埃博拉病毒基因的重组动物原代细胞，埃博拉病毒基因为埃博拉病毒的VP35基因、NP基因、VP30基因和L基因这四种基因中的全部、任三种、任两种或任一种。本发明获得的埃博拉病毒感染细胞模型可用于筛选治疗和/或预防埃博拉病毒的抗体、疫苗或药物，且筛选过程在BSL‑2条件下即可完成，并更接近动物体细胞，在筛选抗体、疫苗或药物中具有更好的准确性。

技术领域

本发明涉及生物医学领域中，埃博拉病毒感染细胞模型的制备与应用。

背景技术

埃博拉病毒(Ebola)是一种单股负链、不分节段、有囊膜的丝状RNA病毒，具有极高致病性，成熟的病毒体由位于中心的核衣壳和外面的囊膜所组成。囊膜表面分布有刺突GP，其与病毒的出芽入侵感染有关。囊膜与核衣壳间即为基质空间，由VP40和VP24组成，其中VP24可以阻断IFN-α/β和IFN-γ信号通路，维持核衣壳功能完整性；VP40在宿主细胞内主要分布在细胞质膜直至病毒颗粒出芽前进行组装，VP40主要功能是维持病毒颗粒结构完整性。核衣壳主要由病毒基因组和核糖核蛋白所组成，其中核糖核蛋白包裹缠绕病毒基因组，调节病毒的转录复制。核糖核蛋白包括VP35、VP30、NP和L，其中L为RNA聚合酶，调控病毒基因组的转录复制；VP35是RNA聚合酶L的辅因子，同时也可以抑制干扰素通路来促进病毒的增殖；VP30是转录激活因子，负责招募RNA聚合酶L发挥功能；NP是核衣壳蛋白。Ebola基因组包括7个基因，基因顺序为3’leader-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5’trailer，其中3’leader和5’trailer端可以调控病毒的转录复制。

Ebola病毒是高致病性的丝状病毒,对人和非人类的灵长类动物的致死率超过50％，2014年Ebola感染暴发导致非洲多国大量人员死亡，同时也对世界各国造成严重影响。由于高致病性，这些病毒都需要在BSL-4级实验室进行操作，严重影响了相关疫苗及药物的开发。

Ebola trVLP系统(即埃博拉转录复制相关病毒样颗粒系统)，由Thomas Hoenen等在2014年提出，可以在BSL-2水平模拟埃博拉病毒生命周期。向P0代细胞转染pCAGGS-VP35，pCAGGS-NP，pCAGGS-VP30，pCAGGS-L，p4cis-vRNA-RLuc以及pCAGGS-T7，细胞可以大量产生Ebola相关蛋白和荧光报告值，Ebola相关蛋白与Ebola基因组进一步组装成成熟病毒颗粒(即埃博拉转录复制相关病毒样颗粒)并释放到上清中，取病毒上清感染提前24h转染过pCAGGS-VP35，pCAGGS-NP，pCAGGS-VP30，pCAGGS-L和pCAGGS-Tim1质粒的P1代细胞，病毒可以入侵P1代细胞，并在P1代细胞中转录复制，包装形成新的病毒颗粒，并产生荧光报告值。以此，Ebola trVLP系统可以在BSL-2水平上模拟埃博拉病毒的生命周期，可以用于筛选药物抗体疫苗等。但是细胞系不同于动物原代细胞，在病毒蛋白表达量、感染方式、药物及抗体动力学等方面存在差异，无法模拟动物水平的实验，因此动物水平的trVLP实验尤为关键。Ebola病毒野生株不具备感染小鼠的能力，可以感染免疫缺陷的小鼠。有研究表明，鼠适应性Ebola病毒能增强Ebola病毒对免疫系统完整的小鼠的感染性，将Ebola病毒基因VP24、NP、GP、VP35中进行突变，增强病毒致病性(Ebihara等，2006)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种利用Ebola trVLP系统(即埃博拉转录复制相关病毒样颗粒系统)制备感染埃博拉病毒的细胞模型，该细胞模型所用细胞为小鼠原代细胞，可以模拟动物水平，进而可以用于筛选药物、抗体和疫苗等。

本发明首先提供了制备埃博拉病毒感染细胞模型的方法，所述方法包括1)和2)：

1)利用Ebola trVLP系统获得埃博拉转录复制相关病毒样颗粒；