[发明专利]一种可体内示踪的肝肿瘤细胞株及其构建方法

说明书

本发明提供了一种稳定携带萤火虫荧光素酶基因（FLuc）及杀稻瘟菌素‑s脱氨酶基因（BSD）的小鼠肝肿瘤细胞株hepa1‑6‑FLuc及其构建方法。采用逆转录病毒将Fluc基因导入小鼠肝肿瘤细胞hepa1‑6，稻瘟菌素筛选稳定表达FLuc基因的hepa1‑6‑FLuc细胞，该细胞具有与亲代hepa1‑6类似的形态及增殖、迁移、侵袭的生物学特性。细胞增殖后植入裸鼠体内，FLuc基因随着细胞增殖而复制，生物荧光活体成像技术检测到不断增强发光信号，可实际反映肝癌细胞的存活和增殖，hepa1‑6‑FLuc是一个建立肝癌动物模型的理想细胞，用于动态监测肿瘤的增殖、存活和转移。该方法可用于构建表达FLuc基因的其他细胞株，为细胞体内示踪提供了一种便捷的方法。

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，公开了一种可用于体内示踪的小鼠肝肿瘤细胞株Hepa1-6-FLuc及其构建方法。

背景技术

肝癌原位移植瘤模型是研究肿瘤转移机制和肿瘤免疫的一个理想模型，进一步筛选抗肿瘤药物和判断疗效。传统的细胞追踪方法通常采用组织病理学技术观察活体组织或在实验终点活体标记细胞。这种方法虽然可以获得移植细胞在实验终点的信息，但无法获得细胞在体内定位、生存、迁移、激活的实时动态信息。体内细胞追踪技术可以实现对实验动物的无创监测，对肿瘤疾病的动态研究具有重要意义。常用的体内示踪技术包括放射性核素显像、磁共振成像、光学成像，活体成像等。其中，生物发光法是基于萤火虫荧光素酶（firefly luciferase, FLuc）能催化底物（D-Luciferin）化学发光的原理，将体外表达荧光素酶的细胞株植入动物体内，与后期注射入体内的底物发生反应，利用光学系统检测光强度，间接反映出细胞数量的变化或细胞的定位，是无创性监测细胞体内示踪的一个有价值的工具。生物荧光活体成像技术具有灵敏度高、定量准确、创伤小、操作简单、直观等优点。目前，在人类生物学和疾病的动物模型中，广泛应用于干细胞移植、肿瘤转移或疾病病理生理的生物学过程等研究领域，特别是生物发光成像技术可以用于体内深部肿瘤的检测。

腺病毒载体转导目的基因具有效率高、滴度高、瞬时转染在体内不与宿主细胞染色体整合等优点，使腺病毒载体在肿瘤的基因治疗研究与实践方面得以广泛运用，重组腺病毒可作为介导Fluc基因在不同动物细胞中的表达。一个成功的肝癌模型，移植的肝癌细胞应在体内快速增殖并形成肿块，然而，腺病毒介导的Fluc表达可能不会持续很长一段时间，导致Fluc-标记细胞的信号与肿瘤生长不一致，可能的原因是腺病毒不整合到宿主细胞基因组的基因，因此限制了来源于移植肿瘤细胞分裂的子代细胞在体内的追踪。

发明内容

本发明的目的是提供一种可体内示踪的肝肿瘤细胞株，本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种小鼠肝肿瘤细胞株Hepa1-6-FLuc，其特征在于：稳定携带萤火虫荧光素酶基因（FLuc）及杀稻瘟菌素-s脱氨酶基因（BSD）。

上述小鼠肝肿瘤细胞株Hepa1-6-FLuc，其细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭能力不低于亲代Hepa1-6细胞，转代至20代以上FLuc基因表达水平下降低于5%，体内植入后随着肿瘤细胞的生长，FLuc基因稳定表达。

本发明的另一目的是提供一种稳定携带萤火虫荧光素酶基因（FLuc）及杀稻瘟菌素-s脱氨酶基因（BSD）细胞株的构建方法，本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种稳定携带萤火虫荧光素酶基因（FLuc）及杀稻瘟菌素-s脱氨酶基因（BSD）细胞株的构建方法，采用逆转录病毒将萤火虫荧光素酶基因（FLuc）及杀稻瘟菌素-s脱氨酶基因（BSD）导入细胞，筛选具有稻瘟菌素抗性的细胞，检测细胞中FLuc的表达，获得稳定表达FLuc细胞株；将细胞株植入小鼠体内，活体生物发光成像技术动态检测细胞在体内的生物发光信号，用于细胞体内长时间示踪。

上述细胞株构建方法，包括以下步骤：