[发明专利]安乃近人工抗原的合成方法

说明书

安乃近人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明采用戊二醛法将4‑氨基安替比林H1与载体蛋白偶联，得到安乃近的人工抗原；或先由4‑氨基安替比林H1和丁二酸酐反应得到安乃近半抗原H1‑HS，再用碳二亚胺法将安乃近半抗原H1‑HS与载体蛋白偶联，即得到安乃近人工抗原。本发明成功合成了安乃近人工抗原，合成步骤简单、安全、有效，完全可用于免疫分析中，为以后的研究提供了必需的人工抗原。

技术领域

本发明涉及两种安乃近人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

安乃近(dipyrone)为临床常用的解热镇痛药之一，属于吡唑酮类解热镇痛药， 自投入临床用于治疗以来已有百年的历史。安乃近在体内可迅速水解成活性产物4-甲氨基安替比林(4-methylaminoantipyrine，MAA)，再进入体循环；MAA在体内代谢为4-甲酰氨基安替比林(4-formylaminoantipyrine，FA)和4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine，AA)；AA可以继续代谢为4-乙酰氨基安替比林(4-acetylaminoantipyrine，AAA)。

安乃近具有较强的解热和镇痛作用，目前在许多国家被广泛使用，但该药能导致粒细胞减少、再生障碍性贫血、严重的过敏和休克虚脱等严重反应。由于其毒副作用和尚不确切的药效作用机理，世界上一些发达国家已经对安乃近作出了停止或限制使用的规定，如美国、瑞典禁止该药物用于食源性动物中，日本的肯定列表亦将其列入一律标准，而欧盟对安乃近在牛奶中的限量要求为 50 µg/kg(以MAA含量计算)。

目前报道的用于安乃近或其类似物的测定方法有分光光度法、流动注射化学发光光度法、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)等，然而，这些仪器分析法都需要复杂的前处理，耗时，耗力，不适合大量样品的快速检测。为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对安乃近的高效、快速的检测方法，而酶联免疫法（ELISA）前处理简单，成本低，可实现大量样品的快速检测，且检测时对样本的纯度要求不高。因此，建立高效的免疫学检测方法很有必要，而建立此方法的一个重要前提即需筛选出针对安乃近的高特异性单克隆单体。

发明内容

本发明的目的是提供两种安乃近人工抗原的合成方法，所制备的产品用于安乃近免疫分析方法研究，为今后的研究提供了必需的人工抗原。

本发明的技术方案，两种安乃近人工抗原的合成方法，第一种，采用戊二醛法将4-氨基安替比林（H1）与载体蛋白偶联，得到安乃近的一种人工抗原。第二种，先由H1和丁二酸酐反应得到半抗原，以下简称为H1-HS，再用碳二亚胺法将半抗原H1-HS与载体蛋白偶联，即得到安乃近的另一种人工抗原。

第一种合成方法具体步骤如下：

（1）A液的制备：称取4-氨基安替比林H1 2.03 mg，溶解在500 μL超纯水中，再加入60 μL 2.5% 戊二醛溶液，冰浴搅拌15 min，得反应液A液；

（2）B液的制备：称取5mg BSA，用1mL 0.01M pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS溶解，得B液；

（3）偶联：将A液逐滴加入到B液中，边加边搅拌，室温搅拌反应2h，得偶联混合液；

（4）透析：取10cm蛋白截留为3kDa的透析袋，煮沸5 min，冷却至室温后，将偶联混合液加入透析袋中，并用pH=7.4、0.01M PBS透析3天，每6 h更换一次透析液，除去多余的小分子化合物，得到安乃近的人工抗原H1-BSA，采用紫外吸收扫描方法鉴定。

第二种合成方法具体如下：

（1）安乃近半抗原H1-HS的合成：

合成路线如下：