[发明专利]一种北芪菇蛋白源抗氧化肽的制备方法

权利要求书

1.一种北芪菇蛋白源抗氧化肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：碱溶酸沉法提取北芪菇蛋白，具体步骤如下：

1)将晒干的北芪菇放入粉碎机中打磨成粉，称取5g的北芪菇干粉，加60ml蒸馏水于100ml试管中充分溶解，用0.5mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调至8.0；

2)将溶液移入两个50ml相同规格的离心管中，放入离心机中，调整离心速度为2700r/min，开始离心，5min后取出，转移上清液至100ml试管中，加盐酸将pH值调至4.5；

3)再次调整离心速度为5000r/min，开始离心，15min后取出，去掉上清液，得到蛋白质沉淀物；

S2：北芪菇蛋白的酶解，具体步骤如下：

1)配制浓度2％的北芪菇蛋白溶液，在pH为7-8，温度在35-45℃条件下，根据加酶量加入蛋白酶，放入恒温水浴锅中水解1-2h；

2)放入95℃的水浴锅中灭酶15min，最后以5000r/min的速度离心15min得到上清液，此上清液即是北芪菇蛋白酶解液；

S3：蛋白酶的筛选，具体步骤如下：

1)选取了木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶，在浓度2％，酶解时间2h，加酶量5000U/g，进行酶解试验；

2)将检测指标设定为DPPH自由基清除率和水解度，筛选得到两种最佳蛋白酶；

S4：加酶方式的选择，具体步骤如下：

1)在筛选出最佳的两种蛋白酶之后，两种酶在各自最适温度和pH值下水解，以及两种酶以1∶1混合，在两种酶各自最适温度和pH值下分别水解，水解条件为浓度2％，酶用量5000U/g，时间2h；

2)测定水解度指标并记录，测定抗氧化肽的DPPH自由基清除率指标并记录，得到最佳加酶方式；

S5：加酶比例的选择，具体步骤如下：

1)确定加酶方式以后，选择两种酶的加酶比例，其他条件为浓度2％，酶用量5000U/g，时间2h；

2)测定水解度指标并记录，测定抗氧化肽的DPPH自由基清除率指标并记录，得到最适合的加酶比例；

S6：单因素试验，具体步骤如下：

1)在确定了两种最佳蛋白酶，加酶方式和加酶比例以后，配制2％浓度的北芪菇蛋白溶液，进行单因素试验；

2)在温度40℃，pH7.5，时间2h的条件下，研究加酶量对DPPH自由基清除率的波动情况并记录和对水解度的波动情况并记录；

3)在温度40℃，酶量5000U/g，时间为2h的条件下，研究pH值对DPPH自由基清除率的波动情况并记录和对水解度的波动情况并记录；

4)在pH值为7.5，酶量5000U/g，时间为2h的条件下，研究温度对DPPH自由基清除率的波动情况并记录和对水解度的波动情况并记录；

5)在pH值为7.5，酶量5000U/g，温度40℃的条件下，研究时间对DPPH自由基清除率的波动情况并记录和对水解度的波动情况并记录；

S7：响应面试验，具体步骤如下：

1)做好单因素试验结果的统计分析，确定最佳范围，以DPPH自由基清除率为因变量，四个因素分别是加酶量，温度，pH，时间，进行四因素三水平试验，根据响应面模拟软件，确定响应面试验方案；

S8：DPPH自由基清除率的测定，具体步骤如下：

1)在100ml容量瓶中加入无水乙醇，称取的DPPH试剂，制得浓度为6.6*10-4mol/L的DPPH溶液；

2)在低温和避光环境下保存，使用时用无水乙醇稀释到浓度6.6*10^-5mol/L，加样并震荡，混合均匀后在避光环境下保存30min；

3)在517nm处测定吸光度，每过三分钟测一次，直至吸光度值保持稳定，每一吸光度值需要进行三次重复试验以减小误差；

S9：水解度的测定，具体步骤如下：

1)采用pH-stat滴定法测定水解度，当在碱性条件下水解时，蛋白质中的肽键会断裂，pH值下降；

2)用稀浓度碱液将溶液pH值调回初始pH值所用的碱量可以计算出水解度

S10：ABTS和清除率试验，具体步骤如下：

1)配制pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液：取氯化钠1.975g，氯化钾0.05g，磷酸二氢钾0.06g，磷酸氢二钾0.45g，用200ml蒸馏水溶解，均匀搅拌，用pH计测得pH为7.2，4℃冰箱保存；

2)配制2.45mmol/L过硫酸钾溶液：取过硫酸钾26.4914mg，用40ml磷酸盐缓冲溶液溶解，搅拌均匀；

3)配制7mmol/L ABTS+·溶液：取2，2’-联氨基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS+·)153.6304mg，用40ml磷酸盐缓冲溶液溶解，搅拌均匀；

4)取上述配制好的过硫酸钾溶液、ABTS+·溶液按1∶1混匀，避光环境下保存12-16h，用磷酸盐缓冲溶液去稀释至吸光度值为0.70±0.02，于734nm处测定吸光度值；

S11：总还原力试验，具体步骤如下：

1)制备pH6.6的PBS缓冲液：称取磷酸二氢钾1.74g，氯化钠1.7g，磷酸氢二钾2.7g，加入蒸馏水溶解成400ml即得；

2)用pH计测得pH为6.6，4℃冰箱中保存，取2ml的待测液加入pH 6.6的PBS缓冲液2.5ml和1％铁氰化钾溶液2.5ml，混合后在50℃条件下水浴放置20min，冷却后加入10％的三氯乙酸溶液1ml，5000r/min离心10min，取上层清液2.5ml，加入2.5ml蒸馏水和0.5ml0.1％三氯化铁溶液，混匀；

3)放置10min后在700nm波长处测定吸光度，以80％的乙醇溶液作为空白组对照，以待测液与空白组对照吸光度的差值为样品的还原能力，以抗坏血酸作为标准对照品进行测定；

S12：分析计算，使用Design-Expert8.0.6.1软件对数据进行方差分析。