[发明专利]一种Diels-Alder反应酶的应用及其突变体的制备方法与应用

说明书

本发明提供一种Diels‑Alder反应酶的应用及其突变体的制备方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明发现氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的Diels‑Alder反应酶，除了能催化底物合成天然D‑A产物，还能催化合成非天然D‑A产物，进一步发现该D‑A反应酶的底物二烯体还包括联苯类、黄酮类、苯并呋喃类。本发明扩宽了D‑A反应酶的底物适用范围，并提供了该酶的突变体，发现这些突变体也能够催化底物合成天然或非天然的D‑A产物。本发明提供的D‑A反应酶及其突变体有助于开发和利用D‑A产物的价值，为其他含有六元环的重要化工前体或天然产物的合成提供了可能性。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种来源于桑树的Diels-Alder(D-A)反应酶在利用非天然二烯体为底物合成非天然D-A产物中的应用，以及该酶的突变体在促进Diels-Alder反应中的应用。

背景技术

Diels-Alder(D-A)反应是共轭二烯(diene)与亲二烯体(dienophile)间发生的[4+2]环化反应，是有机化学中构建碳-碳键的重要方法之一，它能一步生成两个碳-碳键和多个手性中心，构建新的六元环和多个手性中心，迅速提高分子的复杂程度，在合成化学中扮演者重要的角色。自然界中存在大量含有六元环骨架的天然产物，这类分子往往结构复杂，但却具有良好的生物学活性，例如抗癌明星分子紫杉醇(taxol)以及dynemycin A。这类天然产物的全合成往往依赖D-A反应作为关键步骤来构建六元环骨架以及新的手性中心，但由于D-A反应缺乏良好催化剂来控制该反应的区域、endo/exo以及立体选择性，在合成过程中会出现很多副产物从而降低目标产物的产率以及立体选择性，如图1所示，这大大降低了D-A反应在全合成以及药物合成中的应用价值。因此开发和利用能够催化D-A反应进行的酶，使之能够选择性地产生某种特定立体结构(例如图1中圆框所示)的D-A产物不仅具有科学创新的价值，也具有很强的工业应用价值，但遗憾的是，目前从自然界中还未发现能够选择性催化分子间D-A反应的酶。

桑白皮(桑树的根皮或者茎皮)是传统中药，具有抗炎，利尿、平喘等等用途，同时也是治疗艾滋病的复方药物(司艾特散)中的有效成分。桑白皮中富含D-A类型的黄酮类天然产物，这些天然产物结构独特，具有良好的抗菌、抗病毒以及抗糖尿病等的生物活性，推测其是由桑树中的氧化酶以及D-A反应酶(DAase)共同参与而生成的，如图2所示。由于其结构复杂，含有多个手性中心，实现这类天然产物的不对称全合成面临着很大的挑战。相比于化学催化剂，酶具有高效性以及立体选择性，

虽然合成化学家们开发出多种不对称催化剂来实现不对称的D-A反应，并利用但到目前为止还未实现酶催化的高效不对称D-A反应。开发和利用能够催化分子间D-A反应的酶对于有机合成，特别是复杂天然产物的合成具有重要意义。在申请人课题组前期工作中，从桑树中鉴定出几种黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖的Diels-Alder反应酶，并证明这些蛋白可以催化分子间D-A反应生成桑树中几种不同D-A类型天然产物。虽然前期工作已经证明了MaDA及其同源蛋白MaDA-1和MaDA-2有一定的底物耐受性，可以识别不同取代的查尔酮作为亲二烯体以及不同类型的二烯体，但其二烯体底物的适用范围比较有限，这限制了该类蛋白在多样化合成D-A类型天然产物及其类似物的应用。为了进一步拓宽MaDA在合成D-A类型化合物上的应用，有必要探讨MaDA是否能识别和催化非天然的亲二烯体与查尔酮之间的D-A反应，以及制备其活性更高的突变体以达到将MaDA开发成底物适用更广更高效的D-A反应酶的目的。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种Diels-Alder反应酶在合成非天然D-A产物中的应用。

本发明所述的D-A产物特指有机合成化学领域，Diels-Alder反应后的具有六元环结构和多个手性中心的产物。

本发明的第二个目的是提供Diels-Alder反应酶的突变体以及这类突变体在促进D-A反应中的应用。

第一方面，本发明提供的Diels-Alder反应酶来源于桑树，命名为MaDA酶，具有：