[发明专利]阴道毛滴虫荧光免疫层析测定试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种阴道毛滴虫荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于，包括检测卡、SD卡和样品稀释液；

所述检测卡，由一壳体和免疫层析试纸条组成，所述免疫层析试纸条位于壳体内部，包括底板，所述底板上沿其长度方向顺次设置有一样品垫、一结合垫、硝酸纤维素膜和一吸样垫，所述结合垫上固定有荧光微球标记的抗阴道毛滴虫单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上设置有检测T线和质控C线，所述T线上包被有与所述荧光微球标记的单克隆抗体配对的单克隆抗体，所述C线上包被有与所述荧光微球标记的单克隆抗体配对的二抗；

所述SD卡内存储有标准曲线，采用平板计数法与光密度法关系曲线建立定标方式，使用定标浓度与仪器信号值关系曲线建立标准曲线，实现定量检测；

所述样品稀释液包括磷酸盐缓冲液和亲水性表面活性剂。

2.根据权利要求1所述的一种阴道毛滴虫荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于，所述结合垫制备时阴道毛滴虫单克隆抗体与荧光微球质量比为1:50～1:10。

3.根据权利要求1所述的一种阴道毛滴虫荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于，所述结合垫设置封闭1和封闭2，所述封闭1为加入甘氨酸和乙醇胺封闭；所述封闭2为加入BSA和兔IgG封闭，所述BSA与荧光微球质量比为4～2:1，所述兔IgG与荧光微球质量比为0.25～2:1。

4.根据权利要求1所述的一种阴道毛滴虫荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于，所述亲水性表面活性剂优选为吐温20或曲拉通100。

5.根据权利要求4所述的一种阴道毛滴虫荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液以1000重量份计，包括吐温20或曲拉通100 1～5份和余量的磷酸盐缓冲液。

6.权利要求1所述一种阴道毛滴虫荧光免疫层析测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒包括检测卡、SD卡和样品稀释液，

所述检测卡的制备方法为，将吸样垫、结合垫、样品垫依次固定在包被抗阴道毛滴虫单克隆抗体的硝酸纤维素膜底板上，切割成试纸条，加干燥剂于常温下密封保存；

所述结合垫通过以下方法制备：

(1)缓冲液置换：取微粒加入MES缓冲液离心，去除上清，加入少量MES超声重悬，待用；

(2)活化：向微球中加入NHS和EDC，混匀；

(3)清洗：活化结束后，加入MES缓冲液离心，去除上清，加入少量MES超声重悬；加入HEPES缓冲液超声重悬，补满HEPES离心，加HEPES重悬后待用；

(4)抗体反应：加入相应量HEPES预先透析的抗体，阴道毛滴虫单克隆抗体与荧光微球质量比为1:50～1:10，混匀后反应；

(5)封闭1：加入甘氨酸和乙醇胺封闭；

(6)封闭2：加入BSA和兔IgG，BSA与荧光微球质量比为4～2:1，兔IgG与荧光微球质量比为0.25～2:1，混匀后封闭；

(7)清洗：加入PBST清洗两次，加微球保存液清洗一次后，加入适宜量的微球保存液，置于2～8℃保存备用；

(8)铺结合垫：将标记好的微球偶联物稀释至合适的浓度，铺在玻璃纤维上，置于鼓风干燥箱中干燥；

所述包被抗阴道毛滴虫单克隆抗体的硝酸纤维素膜通过以下方法制备：

(1)T线划线液配制：用缓冲液将阴道毛滴虫单克隆抗体稀释至1.0～2.5mg/mL；

(2)C线划线液配制：用缓冲液将羊抗兔IgG抗体稀释至1.0～2.5mg/mL；

(3)采用喷金划膜仪，将C线抗体、T线抗体分别包被在固定于底板上的硝酸纤维素膜上；

(4)将划好的大板置于鼓风干燥箱中干燥；

所述SD卡通过以下方法制备：

(1)阴道毛滴虫平板计数法与光密度法关系曲线建立：配制不同浓度梯度的阴道毛滴虫菌悬液并在600nm波长下分别测定OD值，将不同梯度的菌悬液样品同时做稀释涂平板培养计数，将OD₆₀₀和对应菌体浓度做直线回归，得出回归方程；

(2)参考品制备：将阴道毛滴虫接种于液体培养基中，摇床震荡培养，离心去上清，加入生理盐水洗涤，加入少量细胞冻存液重悬菌体，在600nm波长下测量OD值，根据阴道毛滴虫平板计数法与光密度法关系回归方程，计数出制得的参考品浓度，分装冻存备用；

(3)校准品制备：用样品稀释液将参考品稀释至覆盖线性范围的几个浓度点，分装冻存备用；

(4)校准品测试：取不同浓度的校准品滴加到免疫层析试纸条的加样孔，通过荧光免疫分析仪读取检测信号值；

(5)校准曲线生成：根据校准品的制备浓度和荧光值采用合适的拟合方式生成该批试剂的校准曲线，并用仪器软件将曲线导入SD卡中。