[发明专利]一种合成紫杉二烯的植物表达载体、菌株DZGGPPSTS和盾叶薯蓣及其制备方法

说明书

本发明提供了一种合成紫杉二烯的植物表达载体、菌株DZGGPPSTS和盾叶薯蓣及其制备方法。该载体包含红豆杉牻牛儿基焦磷酸合酶基因GGPPS表达盒CaMV35S‑GGPPS‑Tnos以及红豆杉紫杉二烯合酶基因TS表达盒CaMV35S2‑TS‑CaMV 3'UTR。菌株DZGGPPSTS由所述载体转入根癌农杆菌中得到且保藏编号为CCTCC NO：M2019685；将所述载体通过菌株DZGGPPSTS介导整合到盾叶薯蓣基因组中并通过再生得到能合成紫杉二烯的转基因植株；本发明同时超表达GGPPS基因和超表达TS基因，以盾叶薯蓣作为受体植物，得到合成紫杉二烯能力强的转基因植株。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种合成紫杉二烯的植物表达载体、菌株DZGGPPSTS和盾叶薯蓣及其制备方法。

背景技术

来源于红豆杉的紫杉醇是迄今最重要的植物抗癌药物，从上世纪九十年代以来一直是临床上治疗乳腺癌、子宫癌、肺癌和头颈癌的一线药物，对其它肿瘤的治疗还在研究中。此外，其它紫杉烷抗癌药物(如Taxotere、Abraxane)也相继被开发并在临床上应用，紫杉烷类抗肿瘤药物研究成为药物研发的热点之一。发现新紫杉烷是新药研发的关键。世界上红豆杉资源有限，共11种，我国有4种和1变种，都生长缓慢、紫杉醇和紫杉烷含量很低，一般为干重的0.01％左右，甚至更低。经过20多年的研究，红豆杉中的紫杉烷几乎被分离殆尽，发现新紫杉烷越来越难，即使有，也会因含量太低而不能进行药效学研究。开辟新的紫杉烷资源对于紫杉烷类药物研究具有重要意义。

紫杉二烯是合成紫杉醇和紫杉烷的共同前体物质，利用植物基因工程技术可以使非红豆杉属植物合成紫杉二烯，这为开辟新的紫杉烷资源带来了希望。但已报道的转基因植物中紫杉二烯含量都很低，如拟南芥为0.025mg/kg(干重)、烟草为27mg/kg(干重)、人参为16mg/kg(干重)，不利于发现和分离新紫杉烷。因此，如何培育出合成紫杉二烯能力强的转基因植物成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种合成紫杉二烯的植物表达载体、菌株DZGGPPSTS和盾叶薯蓣及其制备方法。本发明采用同时超表达GGPPS基因以促进紫杉二烯的底物GGPP合成和超表达TS基因以促进GGPP转化为紫杉二烯的策略，以盾叶薯蓣作为受体植物，所得到的转基因盾叶薯蓣植株中紫杉二烯含量大都显著高于已报道的转基因拟南芥、烟草和人参，有利于今后进一步系统分析转基因植株中的紫杉烷成份。

本发明是这样实现的：

本发明的目的之一，在于提供一种合成紫杉二烯的植物表达载体，所述载体包含红豆杉牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合酶基因GGPPS的表达盒和红豆杉紫杉二烯合酶基因TS的表达盒；

所述红豆杉牻牛儿基焦磷酸合酶基因GGPPS的表达盒为CaMV35S-GGPPS-Tnos，包括：花椰菜花叶病毒35S基因启动子序列CaMV35S，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的红豆杉牻牛儿基焦磷酸合酶基因GGPPS，和农杆菌胭脂碱合酶基因终止子序列Tnos；

所述红豆杉紫杉二烯合酶基因TS的表达盒为CaMV35S2-TS-CaMV 3'UTR包括：含重复增强子的花椰菜花叶病毒35S基因启动子序列CaMV35S2、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的红豆杉紫杉二烯合酶基因TS和花椰菜花叶病毒35S基因的3'非翻译序列CaMV 3'UTR。

具体地，所述载体为pCAMBIA-GGPPS-TS，所述载体为在植物双元载体pCAMBIA-Pnos-PNN上克隆有所述红豆杉牻牛儿基焦磷酸合酶基因GGPPS的表达盒CaMV35S-GGPPS-Tnos和所述红豆杉紫杉二烯合酶基因TS的表达盒CaMV35S2-TS-CaMV 3'UTR。