[发明专利]一种合成紫杉二烯的植物表达载体、菌株DZGGPPSTS和盾叶薯蓣及其制备方法

权利要求书

1.一种合成紫杉二烯的植物表达载体，其特征在于，所述载体包含红豆杉牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合酶基因GGPPS的表达盒和红豆杉紫杉二烯合酶基因TS的表达盒；

所述红豆杉牻牛儿基焦磷酸合酶基因GGPPS的表达盒为CaMV35S-GGPPS-Tnos，包括：花椰菜花叶病毒35S基因启动子序列CaMV35S、核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的红豆杉牻牛儿基焦磷酸合酶基因GGPPS和农杆菌胭脂碱合酶基因终止子序列Tnos；

所述红豆杉紫杉二烯合酶基因TS的表达盒为CaMV35S2-TS-CaMV 3'UTR包括：含重复增强子的花椰菜花叶病毒35S基因启动子序列CaMV35S2、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的红豆杉紫杉二烯合酶基因TS和花椰菜花叶病毒35S基因的3'非翻译序列CaMV 3'UTR。

2.如权利要求1所述的一种合成紫杉二烯的植物表达载体，其特征在于，所述载体为pCAMBIA-GGPPS-TS，为在植物双元载体pCAMBIA-Pnos-PNN上克隆有所述红豆杉牻牛儿基焦磷酸合酶基因GGPPS的表达盒CaMV35S-GGPPS-Tnos和所述红豆杉紫杉二烯合酶基因TS的表达盒CaMV35S2-TS-CaMV 3'UTR。

3.一种菌株DZGGPPSTS，其特征在于，该菌株由权利要求2所述的pCAMBIA-GGPPS-TS载体转入根癌农杆菌中得到，且该菌株的保藏编号为CCTCC NO：M2019685。

4.一种合成紫杉二烯的转基因盾叶薯蓣植株，其特征在于，将权利要求1-2所述的红豆杉牻牛儿基焦磷酸合酶基因GGPPS的表达盒CaMV35S-GGPPS-Tnos和所述红豆杉紫杉二烯合酶基因TS的表达盒CaMV35S2-TS-CaMV 3'UTR同时整合到盾叶薯蓣基因组中。

5.一种权利要求4所述的表达紫杉二烯的转基因盾叶薯蓣植株的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1、将权利要求3所得基因工程菌菌株DZGGPPSTS转化盾叶薯蓣细胞，并通过植物组织培养技术获得再生植株；

步骤2、对再生植株进行鉴定，筛选出转基因盾叶薯蓣植株。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中所述基因工程菌菌株DZGGPPSTS转化盾叶薯蓣细胞和获得再生植株的具体步骤为：

S1、在含卡那霉素和利福平的YEP液体培养基中培养基因工程菌菌株DZGGPPSTS后，离心收集菌体，用液体培养基重新悬浮得到的菌液备用；

S2、盾叶薯蓣幼茎消毒后切成小段，接种在愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织并在愈伤组织增殖培养基上进行增殖；将增殖后的愈伤组织块切成薄片，浸泡在步骤S1制备得到的菌液中；

S3、将所述愈伤组织块取出吸干菌液后，转移到共培养基上培养；

S4、共培养结束后，将愈伤组织块转移到选择再生培养基上培养诱导不定芽；

S5、不定芽分别继代在选择再生培养基上进行增殖，每个不定芽增殖所形成的芽构成一个无性系；

S6、将不定芽转到生根培养基上诱导生根、形成完整的转基因植株。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述S1中卡那霉素和利福平的浓度均为50mg/L；所述悬浮用的液体培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+1mg/L BA+0.5mg/L NAA+200μM乙酰丁香酮。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述S2中愈伤组织诱导培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+2mg/L BA+1mg/L NAA；所述愈伤组织增殖培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+1mg/L BA+0.5mg/L NAA；培养条件为温度25±1℃、光照强度30-45μmol m^-2s^-1、光周期16h。