[发明专利]一种非洲猪瘟基因工程疫苗高密度发酵补料培养基及发酵工艺

说明书

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟基因工程疫苗高密度发酵补料培养基及发酵工艺。该非洲猪瘟基因工程疫苗高密度发酵补料培养基包括葡萄糖40‑280g/L、甘氨酸50‑300g/L、MgSO₄ 20g/L和(NH₄)₂SO₄ 20g/L；所述非洲猪瘟基因工程疫苗的氨基酸序列包括下述片段：选自p72蛋白的至少1个中和抗原表位、选自p54蛋白的至少1个中和抗原表位和选自p30蛋白的至少1个中和抗原表位。本发明的发酵工艺可显著提高非洲猪瘟基因工程疫苗的产量。

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟基因工程疫苗高密度发酵补料培养基及发酵工艺。

背景技术

基因工程亚单位疫苗利用DNA重组及DNA序列合成多肽的技术生产的仅包含从病原体中鉴定的保护性蛋白和表位的疫苗。通常情况，其生产的第一步是确定病原体中带有免疫原性的特定抗原DNA片段，第二步是选择适宜的载体进行表达扩增。目前生产上常用大肠杆菌作为原核细胞基因的表达系统。与常规疫苗相比，亚单位疫苗具有以下优点：在大幅度降低抗原数量的同时保留特异性，减少无关抗原引起的副反应；疫苗中不含有任何可致感染的组分、不含有致病因子的核酸成分，因此安全可靠；疫苗还能除去或降低全菌体疫苗引起的免疫抑制反应；便于实现工厂化生产，大量的表达载体能够产出量大、安全、有效、廉价的抗原。

基因工程菌，是采用基因工程相关技术制成的重组菌。一般是把目的基因导入细菌细胞内，从而表达所需蛋白。高密度发酵技术，也称为高密度细胞培养技术，通常是根据细菌的培养特性，优化改进培养条件和方式后，细菌密度能够大幅度提高，进而表达产物的量也有所提升的一种细菌培养技术。

基因工程菌高密度发酵的最终目的是获得大量的外源基因表达产物，因此，人们利用基因重组技术，使更多的外源基因可以在微生物中表达，以期获得更多量的外源基因表达产物。因此，对基因工程菌高密度发酵技术的研究，顺应当前生物制品生产的需要。

人类对大肠杆菌(E.coli)的遗传背景较为了解，加之其容易培养，生长速度快，可以表达大量的蛋白产物，所以成为了目前最成熟的一种表达系统，应用十分广泛。在过去，获得某些天然蛋白常常是无法实现的，但对基因工程重组大肠杆菌进行高密度发酵后诱导表达，可以生产出很多天然蛋白。重组大肠杆菌高密度发酵技术，使得培养体积大幅较少，还能够强化下游工艺中的分离、提取，在生产过程中，不需要过多的设备投资，能够有效提高生产效率，降低生产成本。Riesenberg D(Riesenberg D.High-cell-densitycultivation of E.coli[J].Curr Op-in Biotechnol，1991，2(3):380-384.)在研究中发现，大肠杆菌菌体在培养过程中，考虑培养基和培养条件等其他因素后，其理论上的最高密度可达200g/L；通常情况下，当大肠杆菌菌体干细胞质量超过50g/L，就可以认为大肠杆菌达到了高密度发酵水平。

在使用半合成培养基进行大肠杆菌高密度发酵时，通常需要加入其它营养物质来促进菌体生长及代谢产物的形成。现代科学研究表明，向培养基中添加适当量的营养物质能够有效改善大肠杆菌的生长代谢，但要掌握好添加量，倘若营养物质的浓度过高会对菌体生长形成抑制从而降低产量。根据Riesenberg报道，培养基中各成分的浓度上限分别为：氮2.9g/L、葡萄糖48g/L、Mg²⁺8.8g/L、Fe²⁺1.13g/L、PO₄^3-9.5g/L、Zn²⁺0.039g/L。重组大肠杆菌高密度发酵技术，通常选取的基础培养基是LB培养基，然后在此基础上运用统计学方法设计实验，优化培养基组分及各组分添加的比例和量，最终得到优化培养基。