[发明专利]一种不同来源肝前体样细胞的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及细胞模型技术领域，具体是一种不同来源肝前体样细胞的制备方法，是将肝实质细胞和/或肝非实质细胞通过肝细胞转化增殖培养基诱导培养后，转化为可在体外扩增并传代的肝前体样细胞。本发明通过运用谱系示踪的方法，分离小鼠肝脏中的实质与非实质细胞，通过体外小分子组合诱导培养，二者均成功转化为具有增殖再生功能的肝前体样细胞，同时通过三维培养及类器官培养后证明，二者均保持了其细胞来源的特性。本发明有助于进一步研究不同来源肝前体细胞生物学形态学特性，深入探索其作为新的移植细胞来源的应用前景。

技术领域

本发明涉及细胞模型技术领域，具体地说，是一种不同来源肝前体样细胞的制备方法及其应用。

背景技术

今年研究表明，谱系示踪模型通过特定的荧光信号标记细胞，在肝脏处于不同的状态下研究其来源，演化及最终去向(Tarlow,B.D.,C.Pelz,W.E.Naugler,L.Wakefield,E.M.Wilson,M.J.Finegold,and M.Grompe,Bipotential adult liver progenitors arederived from chronically injured mature hepatocytes.Cell Stem Cell,2014.15(5):p.605-18.)。其全程可视化的优势使其备受各研究团队的青睐。在肝再生研究领域中，近年来众多研究通过对不同细胞表面标记物示踪，发现当肝脏处于慢性损伤状态，其实质细胞及非实质细胞均有可能转化为肝前体细胞，当通过流式细胞术利用荧光标记分离不同来源的肝前体细胞，发现其在体外培养中均具备肝向及胆向分化的潜能，然而由于体内内源性肝前体细胞数量极少的这一天然阻碍，对不同来源的肝前体细胞进行深入细胞学特性及功能探索仍相当受限。

另外，近年研究表明，体外通过应用不同小分子组合配比，可有效对肝实质细胞及非实质细胞进行三维培养及类器官(Organoid)培养，并在培养过程中，可长时间较稳定维持细胞特性(Hu,H.,H.Gehart,B.Artegiani,L.O.-I.C,F.Dekkers,O.Basak,J.van Es,S.M.Chuva de Sousa Lopes,H.Begthel,J.Korving,M.van den Born,C.Zou,C.Quirk,L.Chiriboga,C.M.Rice,S.Ma,A.Rios,P.J.Peters,Y.P.de Jong,and H.Clevers,Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3DOrganoids.Cell,2018.175(6):p.1591-1606e19.)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种不同来源肝前体样细胞的制备方法及其应用。

本发明通过运用肝细胞转化增殖培养基(Transition and Expansion Medium，TEM)，经过一定时间诱导培养后，将肝实质细胞(hepatocytes)及非实质细胞(non-parenchymal-cell,NPC)转化为可在体外扩增并传代的肝前体样细胞(分别为HepLPCs及NPC-LPCs)，并在体外联合三维培养及类器官(Organoid)培养验证其功能特性。

本发明的第一方面，提供一种不同来源肝前体样细胞的制备方法，是将肝实质细胞(hepatocytes)和/或肝非实质细胞(non-parenchymal-cell,NPC)通过肝细胞转化增殖培养基(TEM)诱导培养后，转化为可在体外扩增并传代的肝前体样细胞(称为HepLPCs和/或NPC-LPCs)。

进一步的，所述的不同来源肝前体样细胞的制备方法，包括以下步骤：

(A)分离获得来自小鼠肝脏的原代实质细胞和/或非实质细胞后，将细胞以2×10⁴/cm²的密度种到经胶原包被过的培养皿中，用肝细胞转化增殖培养基(TEM)培养基培养；