[发明专利]一种不同来源肝前体样细胞的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种不同来源肝前体样细胞的制备方法，其特征在于，是将肝非实质细胞通过肝细胞转化增殖培养基诱导培养后，转化为可在体外扩增并传代的肝前体样细胞；所述的肝细胞转化增殖培养基为TEM培养基，其具体为在DMEM/F12 培养基基础上，添加有N2添加剂、B27添加剂、0.5~1.5mmol/L丙酮酸钠、5~50μg/mL抗坏血酸维生素C、5~25 ng/mL肝细胞生长因子HGF、5~25ng/mL表皮细胞生长因子EGF、5~20μmol/L ROCK激酶抑制剂Y27632、1~5μmol/L Wnt信号通路激动剂CHIR99021。

2.根据权利要求1所述的不同来源肝前体样细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（A）分离获得来自小鼠肝脏的原代非实质细胞后，将细胞以2×10⁴/cm²的密度种到经胶原包被过的培养皿中，用肝细胞转化增殖培养基（TEM）培养；

（B）细胞在1周后可基本长满，然后将细胞用少许Accutase 消化酶消化，将细胞置于37°C孵箱中孵育3~5分钟后，轻轻拍打培养皿可见细胞在消化液中如泥沙样漂浮，往培养皿中加入体积为消化液1倍的含有血清的完全培养基去终止消化，将培养皿中的培养基用吸引器吸走后，之后用移液管轻轻吹打细胞后吸入玻璃离心管内，900转速、3分钟离心，吸走上清，以1：2的比例传代；当细胞进入倍增时间为15-20小时的指数扩增时，获得可以以稳定的增长速度进行增殖传代的肝前体样细胞。

3.采用如权利要求1或2所述的制备方法制备得到的肝前体样细胞。

4.一种肝前体样细胞的三维培养及类器官培养方法，其特征在于，所述的肝前体样细胞为采用如权利要求1或2所述的制备方法制备得到的肝前体样细胞，包括以下步骤：

三维培养：2mL肝细胞转化增殖培养基（TEM）重悬约1×10⁶肝前体样细胞，种植于低粘附6 孔板中1 孔，同时置于细胞培养CO₂孵箱内摇床上培养；6 小时后细胞逐渐凝聚成球状，2-3天加入0.5mL肝细胞转化增殖培养基（TEM）继续培养5-7 天；

类器官三维培养：肝前体样细胞以2×10⁴/mL浓度重悬于50%浓度的matrigel中，移入24孔板的一个角落里，常温下放置2小时使matrigel凝固，再加入500uL肝细胞转化增殖培养基（TEM）继续培养5-7 天。

5.肝细胞转化增殖培养基（TEM）在制备肝前体样细胞中的应用，所述的肝前体样细胞的来源为肝非实质细胞；所述的肝细胞转化增殖培养基是在DMEM/F12 培养基基础上，添加有N2添加剂、B27添加剂、0.5~1.5mmol/L丙酮酸钠、5~50μg/mL抗坏血酸维生素C、5~25 ng/mL肝细胞生长因子HGF、5~25ng/mL表皮细胞生长因子EGF、5~20μmol/L ROCK激酶抑制剂Y27632、1~5μmol/L Wnt信号通路激动剂CHIR99021；且所述应用为非疾病诊断和治疗目的中的应用。

6.肝细胞转化增殖培养基（TEM）在制备功能肝细胞中的应用，所述的功能肝细胞的来源为肝非实质细胞；所述的肝细胞转化增殖培养基是在DMEM/F12 培养基基础上，添加有N2添加剂、B27添加剂、0.5~1.5mmol/L丙酮酸钠、5~50μg/mL抗坏血酸维生素C、5~25 ng/mL肝细胞生长因子HGF、5~25ng/mL表皮细胞生长因子EGF、5~20μmol/L ROCK激酶抑制剂Y27632、1~5μmol/L Wnt信号通路激动剂CHIR99021；且所述应用为非疾病诊断和治疗目的中的应用。