[发明专利]基于ddPCR检测人循环肿瘤细胞KRAS基因突变的引物、探针、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种基于ddPCR检测人循环肿瘤细胞KRAS基因突变的引物探针组、试剂盒及方法。其中，引物探针组包括检测KRAS基因2号外显子上第12号、第13号密码子突变位点的引物及探针，其中，各突变位点分别为：G12D、G12V、G12A、G12C、G12S、G12R以及G13D。本发明提供的引物和探针具有灵敏度高、特异性强的优点，引物和探针能够特异性结合突变序列，且结合稳定，能够实现单拷贝模板条件下的有效扩增，且单模板扩增的ddPCR可以消除野生型模板带来的干扰。本发明提供的试剂盒具有高效、成本低、精度高、灵敏度高、准确度高、重复性好、样本投入低、可以进行绝对定量检测的优点。

技术领域

本发明属于PCR检测领域，特别涉及一种基于ddPCR检测人循环肿瘤细胞KRAS基因突变的引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

EGFR靶向药及单抗只对KRAS野生型有效，然而20% 非小细胞肺癌(NSCLC)、30-35%大肠癌患者中存在KRAS基因突变；晚期转移性结直肠癌（mCRC）患者，在治疗前必须进行K-ras检测，只有野生型才建议抗EGFR抗治疗；最新发布的抗KRAS新药——AMG 510的1期临床试验结果，对NSCLC总的疾病控制率高达90%，对非肺癌患者总的疾病控制率达74%，数据显示该靶向药对KRAS G12C有高度选择性，且效果显著。

因此，检测KRAS基因突变是深入了解癌基因状况、预测癌症的发展及预后、预测放化疗疗效的重要指标。

KRAS基因属于致癌基因，负责控制基因转录活动和细胞循环周期，与细胞增殖相关。K-Ras与GTP分子结合进入激活状态，启动增值；当GTP转换成GDP时，K-Ras失活，信号传递终止。KRAS突变之所以能致癌，是因为第12位氨基酸从甘氨酸变成了缬氨，这种变化，改变了KRAS蛋白质的结构并使其一直处于激活状态，进而使细胞增殖失控，导致肿瘤的形成。

KRAS基因突变96%发生在第2号外显子的12、13号密码子，KRAS G12C突变约占39%，KRAS G12V突变约占18-21%，KRAS G12D突变约占17-18%；且AMG 510的靶向突变为KRASG12C。鉴于此，本发明检测范围包含全部2号外显子的12、13号密码子热点突变：G12D、G12V、G12A、G12C、G12S、G12R、G13D 7个突变点。

目前对KRAS突变的主要检测方法有：Sanger测序法、ARMS PCR、Real-time PCR、NGS等。Sanger测序法可以直接检测出序列信息，但需要以肿瘤样本作为检材，且取样要求高，批量检测时操作复杂、检测时间长、数据解读耗时，且敏度不高，要求突变频率达到20%～30%，这些问题限制了其在临床检测上的应用。ARMS PCR是目前KRAS突变检测的经典方法，可以以石蜡包埋样本作为检材，检测精度可达到1%，但在检测突变丰度低于1%的样本时，存在一定的局限性。Real-time PCR与ARMS PCR类似，仍需以肿瘤切片为检材，难以检测突变丰度低于1%的样本，且无法排除假阳性。以上需要以肿瘤组织作为检材的技术方案，对于不适于开刀取样的病人，如年纪大或有并发症的患者、手术后需要监控病情发展的患者，是并不适用的。NGS的检测灵敏度大大提升，可用于无创检材，且可以一次检测明确多种肿瘤标志物，给用药提供更多的指导，但KRAS突变集中，且在初期用药选择、中期耐药检测等时，都需要对KRAS进行检测，高频率的检测，使用NGS检测不经济且无必要性。