[发明专利]基于ddPCR检测人循环肿瘤细胞KRAS基因突变的引物、探针、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种基于ddPCR检测人循环肿瘤细胞KRAS基因突变的引物探针组，其特征在于，包括检测KRAS基因2号外显子上第12号、第13号密码子突变位点的引物及探针，其中，各突变位点分别为：G12D、G12V、G12A、G12C、G12S、G12R以及G13D；

其中，用于检测KRAS基因2号外显子上第12号密码子各突变位点的上游引物序列为：

GATTCTGAATTAGCTGTATCGTC（SeqID NO:1），

用于检测KRAS基因2号外显子上第12号密码子各突变位点的下游引物序列为：

GGCCTGCTCAAAATGACTG（SeqID NO:2），

用于检测KRAS基因2号外显子上第13号密码子突变位点的上游引物序列为：

GGTCCTGCACCAGTAATATG（SeqID NO:3），

用于检测KRAS基因2号外显子上第13号密码子突变位点的下游引物序列为：

TAGGCAAGAGTGCCTTGAC（SeqID NO:4），

用于检测KRAS G12D突变位点的荧光探针序列为：

CCTACGCCACTAGCTCCAAC（SeqID NO:5）

用于检测KRAS G12V突变位点的荧光探针序列为：

CCTACGCCACAAGCTCCAAC（SeqID NO:6），

用于检测KRAS G12A 突变位点的荧光探针序列为：

CCTACGCCACGAGCTCCAAC（SeqID NO:7），

用于检测KRAS G12C 突变位点的荧光探针序列为：

CCTACGCCAACAGCTCCAAC（SeqID NO:8），

用于检测KRAS G12S突变位点的荧光探针序列为：

CCTACGCCATCAGCTCCAAC（SeqID NO:9），

用于检测KRAS G12R突变位点的荧光探针序列为：

CCTACGCCAGCAGCTCCAAC（SeqID NO:10），

用于检测KRAS G13D突变位点的荧光探针序列为：

GATCATATTCGTTCACAAAATG （SeqID NO:11）。

2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，各荧光探针序列的5’端具有荧光基团，3’端具有淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的引物探针组，其特征在于，用于检测KRAS基因2号外显子上第12号密码子各突变位点的上游引物采用与荧光探针序列不同的荧光基团标记。

4.一种基于ddPCR检测人循环肿瘤细胞KRAS基因突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品中的DNA来源为K562细胞系DNA，所述阳性对照品中的DNA来源为人工合成的具有相应的KRAS基因突变的质粒。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括PCR预混液，该PCR预混液包括dNTPs、Taq酶及PCR缓冲液。

8.一种基于ddPCR检测人循环肿瘤细胞KRAS基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）富集分离循环肿瘤细胞，得到循环肿瘤细胞收集液样本；

（2）将引物、荧光探针、PCR预混液和步骤（1）得到的循环肿瘤细胞收集液样本混合，制备数字PCR混合液；

（3）利用步骤（2）所制备的数字PCR混合液，通过微滴制备仪制备可独自进行PCR扩增反应的PCR微反应液滴；

（4）对步骤（3）所制备的PCR微反应液滴进行PCR扩增反应；

（5）对经步骤（4）PCR扩增反应后的产物进行信号收集，检测荧光信号的有无及其强度，以判断样本中每个突变位点的突变结果。