[发明专利]一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法

说明书

本发明提供了一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法，属于分子生物学、体外分子诊断技术领域，所述方法包括如下步骤：(1)将液体生物样品与皂苷溶液混合均匀，室温下静置5‑30分钟，使宿主细胞等非目标成分的细胞特异性裂解，得混合物，混合物中皂苷的终浓度为0.02‑1.7％；(2)将混合物高速离心，离心后倒掉上清液，得到第一沉淀；(3)向第一沉淀中加入核酸酶反应液和核酸酶，核酸酶包含10‑200个酶单位，目的是降解样品中非目标成分，以宿主核酸为主；(4)将核酸酶灭活；(5)富集目标微生物2。可以检测出浓度低至约2.0CFU/mL的致病菌，满足对诸如血流感染等感染性疾病的临床诊断要求；本发明所使用的试剂和设备少，成本低，工艺简单，应用范围广泛。

技术领域

本发明涉及分子生物学、体外分子诊断技术领域，具体涉及一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法。

背景技术

致病微生物如细菌、支原体、衣原体、立克次氏体及螺旋体是导致感染以及传染疾病的主要致病因素，其通过接触或其他媒介进入人体，引起疾病的发生。在感染疾病发展的过程中，部分病原体通过各种途径可进入患者血液循环，或出现在不同类型的体液之中如脑脊液、体内器官的积液、脓液等，或出现在通过医学手段刻意获得的器官灌洗液如支气管肺泡灌洗液之中。因此，从这些不同来源获取的液体生物样本成为了诊断存在于体内的感染病原体的有效途径。

然而，能够进入上述各类生物液体之中的病原体数量通常很少，尤其是在疾病发展的初期。例如，在血液感染的患者中，血液样本中致病菌浓度可能仅为每毫升样品含1-5个集落形成单位(CFU)。同时，血液样本中含有大量的宿主细胞及细胞碎片如红细胞、白细胞、血小板等，其中白细胞数量可超过每毫升4,000,000个。

通过检测病原体的核酸而达到诊断样本中病原体的存在，分子生物学诊断技术能够快速、灵敏和特异地检测存在于液体生物样本中的病原微生物。当前流行的方法是，首先裂解液体生物样本中所有的细胞包括宿主细胞及目标致病微生物，而后提取样本中的总核酸用于分子诊断。但液体生物样本如血液中存在大量的宿主细胞及其碎片和释放的游离核酸，加之作为检测目标的病原微生物数量稀少，使得分子生物学方法诊断导致诸如血液感染之类疾病的致病微生物变得十分困难。具体原因包括：

第一，样本中宿主细胞裂解时释放的高浓度的宿主核酸会竞争核酸捕获材料，影响病原微生物核酸的提取效率。

第二，高浓度的宿主核酸在目标病原微生物核酸序列的扩增反应(PCR反应)过程中会竞争反应的引物、酶等试剂，可能导致大量非特异性扩增产物的生成，抑制目标病原微生物核酸序列的扩增。

第三，在使用高通量测序(NGS)方法检测目标病原微生物时，高浓度的宿主核酸会导致宿主核酸序列占据大部分的测序数据，从而挤占并压缩目标病原微生物核酸序列的测序数据量，降低检测的灵敏度和准确性。由于上述原因，目前可获得的分离和检测生物样本中目标微生物的方法和试剂盒大多不适用于液体生物样本，因此，目前的检验医学领域对适用于分离和鉴定大体积液体生物样本中极微量致病微生物的方法及试剂盒存在强烈需求。

发明内容

针对上述现有的可获得的分离和检测生物样本中目标微生物的方法和试剂盒大多不适用于液体生物样本的缺陷，本发明提供一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法。

一种液体生物样品中选择性去除宿主核酸的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将液体生物样品与皂苷溶液混合均匀，室温下静置5-30分钟，使宿主细胞等非目标成分的细胞特异性裂解，得混合物，混合物中皂苷的终浓度为0.02-1.7％；

(2)将混合物高速离心，离心后倒掉上清液，得到第一沉淀；

(3)向第一沉淀中加入核酸酶反应液和核酸酶，核酸酶包含10-200个酶单位，目的是降解样品中非目标成分，以宿主核酸为主；

(4)将核酸酶灭活；