[发明专利]PirB基因敲除小鼠动物模型及其构建方法

说明书

本发明公开了PirB基因敲除小鼠动物模型及其构建方法，通过以下方法获得：基于CRISPR/Cas9技术，将C57BL/6J小鼠PirB基因待敲除的特异性靶位点gRNA1和gRNA2分别与trancrRNA在25℃孵育10min形成发夹结构；将有活性的gRNA1、gRNA2、Cas9酶和制备好的含有cKO区、同源臂和loxP位点打靶载体显微注射入代孕小鼠受精卵中获得F0代小鼠，再依次获得F1代杂合子小鼠、F2代纯合子小鼠，即得到本发明PirB基因敲除小鼠的模型。本发明对于PirB基因功能的研究和在体验证提供了良好的基础，特别是敲除PirB后对AD表型和病理学症状的研究具有很高的研究价值。

技术领域

本发明属于遗传学和生物技术领域，具体涉及PirB基因敲除小鼠动物模型，还涉及该小鼠动物模型的构建方法。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病。随着世界人口老龄化不断加剧，AD发病率也在逐年上升，给患者及家属带来极大的生理痛苦和经济负担。AD典型的病理学症状之一是β-淀粉样蛋白(Amyloid-β，Aβ)沉积引起的细胞外老年斑，研究发现Aβ沉积，特别是Aβ42寡聚体会导致神经元退行性病变，包括神经元轴突回缩和突触丢失等。

成对免疫球蛋白样受体B(paired immunoglobulin-like receptor B， PirB)，是Aβ42寡聚体的高亲和力受体，亲和力达到纳摩尔水平。PirB 广泛表达于神经元和星形胶质细胞。免疫组织化学染色结果发现， PirB在富含肌动蛋白(actin)的轴突生长锥前缘和突触蛋白(synapsin) 免疫阳性的囊泡中表达，呈点状分布。文献表明，PirB表达随年龄增加而增加，且PirB表达与轴突再生和突触可塑性负相关。PirB胞外段有6个免疫球蛋白(IgG)样结构域，其前两个IgG结构域介导了 Aβ42寡聚体和PirB的相互作用，导致丝切蛋白(cofilin)信号通路增强，引起轴突生长锥塌陷，轴突生长抑制。研究表明Aβ与PirB相互作用导致海马长时程增强(LTP)抑制，在AD转基因模型中，PirB 不仅参与成年小鼠记忆缺失，而且介导青年视皮层突触可塑性的丢失。这些研究均提示我们PirB参与突触可塑性，引起神经功能下降。因此阻断PirB通路增强突触可塑性可能是预防或改善AD的有效途径。

PirB基因(NCBI reference sequence：NM_011095.2)位于小鼠的7号染色体，总大小为8.97kb，编码841个氨基酸，目前鉴定出 15个外显子(转录本：Pirb-201ENSMUST00000078451.6)。以往文献报道了敲除PirB跨膜区(外显子10)和部分胞内段(外显子11-13) 的C57BL/6小鼠，也有文献采用基因重组的方法敲除PirB靠近跨膜区的胞外段(外显子6)，在这些小鼠动物模型中，PirB均被全身性的敲除，不能用于研究特定细胞或脑区中PirB的作用，更不利于研究PirB在阿尔茨海默病中的作用研究。因此，本发明采用CRISPR/Cas9技术建立能够进行条件敲除PirB的FloxP小鼠，将外显子10-15作为条件敲除的区域，跟特定脑组织和不同神经细胞类型的Cre小鼠杂交后，用于研究PirB条件性敲除参与AD发病的机制，并探索PirB条件性敲除改善AD症状和病理学变化的可能性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种PirB基因敲除小鼠动物模型，该模型可以用于研究不同脑组织或不同类型神经细胞PirB基因敲除后的变化和下游机制。

本发明的另一目的在于提供上述小鼠动物模型的构建方法。

本发明所采用的第一种技术方案是：PirB基因敲除小鼠动物模型，小鼠动物模型是通过以下方法获得：

步骤1、基于CRISPR/Cas9技术，根据PirB基因信息确定 C57BL/6J小鼠PirB基因待敲除的特异性靶位点gRNA1和gRNA2， gRNA1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，gRNA2的基因序列如SEQ ID NO.2所示；