[发明专利]PirB基因敲除小鼠动物模型及其构建方法

权利要求书

1.PirB基因敲除小鼠动物模型，其特征在于，所述小鼠动物模型是通过以下方法获得：

步骤1、基于CRISPR/Cas9技术，根据PirB基因信息确定C57BL/6J小鼠PirB基因待敲除的特异性靶位点gRNA1和gRNA2，所述gRNA1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述gRNA2的基因序列如SEQ ID NO.2所示；

步骤2、通过PCR扩增C57BL/6J小鼠PirB基因的同源臂和cKO区域，采用in-fusion方法构建含有loxP位点的打靶载体；

步骤3、将有活性的gRNA1、gRNA2、Cas9蛋白和含有loxP位点线性打靶质粒载体显微注射入代孕小鼠受精卵中，繁育获得F0代小鼠；

步骤4、将步骤3中性成熟的阳性F0代小鼠分别与野生型异性小鼠交配繁殖一代，获得F1代杂合子小鼠；

步骤5、将步骤4获得的F1代杂合子小鼠近交获得F2代纯合子小鼠，即为本发明构建的PirB基因敲除的小鼠动物模型。

2.根据权利要求1所述的PirB基因敲除小鼠动物模型，其特征在于，所述gRNA1、gRNA2的敲除位点依次为小鼠PirB基因编码区的第10个外显子上和15个外显子上。

3.根据权利要求1所述的PirB基因敲除小鼠动物模型，其特征在于，所述步骤1中得到gRNA1和gRNA2后，将gRNA1和gRNA2分别与trancrRNA在25℃孵育10min形成发夹结构。

4.根据权利要求1所述的PirB基因敲除小鼠动物模型，其特征在于，所述步骤3中注射进入受精卵的gRNA1、gRNA2的浓度均为2～5pmol/ul，Cas9蛋白的浓度为30～100ng/μL。

5.一种权利要求1所述的PirB基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1、分别获取C57BL/6J小鼠PirB基因序列的第10、15号外显子的基因序列，基于CRISPR-Cas9系统构建第10号外显子的gRNA1，所述gRNA1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，基于CRISPR-Cas9系统构建第15号外显子的gRNA2，所述gRNA2的基因序列如SEQ ID NO.2所示；

步骤2、通过PCR扩增C57BL/6J小鼠PirB基因的同源臂和cKO区域，采用in-fusion方法构建cKO区两端含有loxP位点的打靶质粒载体，通过PCR及测序对打靶载体进行验证，并通过酶切获得线性化打靶载体质粒。

步骤3、将步骤1得到的gRNA1、gRNA2、步骤2得到的线性化的含有loxP位点打靶载体和Cas9蛋白注射进入代孕C57BL/6J小鼠受精卵中，繁育获得F0代小鼠；

步骤4、提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增产物测序，鉴定是否为嵌合体；

步骤5、将步骤4中性成熟的阳性F0代小鼠与野生型异性小鼠交配获得F1代杂合子小鼠，PCR扩增、测序和Southern杂交，验证小鼠基因型；

步骤6、将步骤5中F1代杂合子小鼠近交获得F2代纯合子小鼠，即为本发明构建的小鼠动物模型。

6.根据权利要求5所述的PirB基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤1中得到gRNA1和gRNA2后，将gRNA1和gRNA2分别与trancrRNA在25℃孵育10min形成发夹结构。

7.根据权利要求5所述的PirB基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤5中Southern杂交所用的限制性内切酶为Bsu36I，浓度为10000U/mL，用量0.5mL，片段大小如下：4.13kb-WT,3.56kb-MT。