[发明专利]一种降低水解副反应程度的环糊精葡萄糖基转移酶突变体

说明书

本发明公开了一种降低水解副反应程度的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明是通过将编码突变体A133V的基因转入大肠杆菌BL21(DE3)异源表达，获得重组菌BL21(DE3)/pET20b(+)‑A133V，利用该重组菌发酵产酶突变体A133V，其转苷活性与水解活性比例为野生酶的2.5‑2.6倍，大大提升了转苷活性与水解活性的比例，对于工业化生产具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种降低水解副反应程度的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)是一种多功能酶，它能催化四种反应，包括：三种转糖苷反应(歧化反应、环化反应、偶合反应)和水解反应。CGTase可通过环化反应将淀粉转化为环糊精，环糊精能与许多客体分子形成包合物，从而改变客体分子的物理和化学性质，在食品、香料、医药、农药、化工等行业中有着广泛应用。CGTase还可通过偶合和歧化反应，先将淀粉或环糊精这些糖分子作为供体转移到各种受体分子上，从而改善受体分子的性质，如CGTase催化低聚糖转移到蔗糖或果糖上可以制备难蚀性的偶合糖，催化甜菊苷、橙皮苷、芸香苷、L-抗坏血酸、鼠李糖等糖基化，显著提高这些物质的使用性能。

CGTase凭借优异的转苷性能在食品和医药等领域应用广泛，然而CGTase还能够通过水解反应将淀粉底物水解成葡萄糖和麦芽糖等小分子糖，降低淀粉的利用率，不利于转苷产物产量的提升，同时小分子糖副产物的存在，还容易产生产物抑制，导致转化率低。

目前，在CGTase催化歧化和水解反应方面的研究，主要集中于歧化反应到水解反应的转变，而如何削弱水解反应强化歧化反应的研究甚少，仅见于个别报道。RonanM.KELLY等通过来源于Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes的CGTase的定向进化以降低其水解副反应程度，获得了位于活性中心外部区域的突变体S77P和W239L，其歧化/水解比值分别提高2倍和1.2倍。

因此，提供一种进一步降低环糊精葡萄糖基转移酶的水解副反应程度的方法及突变体，提升转苷活性与水解活性的比例，将更加有利于工业化生产。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，含SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第133位的丙氨酸(Ala)突变为缬氨酸(Val)，命名为A133V。

在一种实施方式中，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。

在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pUC系列载体、pET系列载体或pGEX系列载体中的任意一种。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET20b(+)。

本发明的第四个目的是提供表达所述突变体的细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞为细菌或真菌细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或短小芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。