[发明专利]一种宏基因组绝对定量的方法

说明书

本发明涉及宏基因组绝对定量的方法。方法包括：在样品中添加第一定量DNA片段；对所述样品进行基因组DNA的提取；在所述提取的基因组DNA中添加第二定量DNA片段，得到总基因组；对所述总基因组进行宏基因组文库构建和测序；利用得到的测序结果的数据计算单位质量的所述样品中的细菌数量。通过本发明的方法获得细菌的绝对定量，不用采用高成本的流式细胞计数，也不用对特定的DNA进行定量PCR，简化了过程并且降低了成本。

技术领域

本发明涉及宏基因组绝对定量的方法。

背景技术

目前16S和宏基因组测序研究中，菌群的数量和结构主要通过相对丰度来表示，然而基于相对值的菌群分析方法局限性较大。因此，实现对单个菌株或者目标基因的绝对定量，对于研究菌群功能具有十分重要的意义。在绝对定量的过程中，不同样品(如粪便或土壤样本)之间、甚至同一样品的多个重复之间DNA提取得率的差异同样也会显著影响目标菌株的绝对定量结果。

发明内容

本发明通过分别在粪便样本基因组DNA(genomic DNA,gDNA)提取前和提取后加入两段已知长度、序列和准确质量的标准品DNA片段(sDNA1和sDNA2)；通过一系列计算方法，结合提取gDNA所用的粪便质量，最终得出单位质量粪便中细菌的分子数。本发明的方法无需进行qPCR定量或者流式细菌计数，操作简单易行且实验成本低。

本发明提供了一种细菌定量的方法，包括：在样品中添加第一定量DNA片段；对所述样品进行基因组DNA的提取；在所述提取的基因组DNA中添加第二定量DNA片段，得到总基因组；对所述总基因组进行宏基因组文库构建和测序；利用得到的测序结果的数据计算单位质量的所述样品中的细菌数量。

在上述方法中，其中，所述样品为粪便样品。

在上述方法中，其中，所述第一定量DNA片段的序列为序列1。

在上述方法中，其中，所述第二定量DNA片段的序列为序列2。

在上述方法中，其中，所述样品中的所述第一定量DNA片段的分子数为：测序所得的所述第一定量DNA片段的拷贝数与单位质量的所述样品中加入的所述第二定量DNA片段的分子数的乘积再除以测序所得的所述第二定量DNA片段的分子数。

在上述方法中，其中，所述样品中的基因组DNA的得率为：单位质量的所述样品中的所述总基因组中的所述第一定量DNA片段的分子数除以加入的所述第一定量DNA片段的分子数，之后再乘以所述样品中的基因组DNA的总量。

在上述方法中，其中，单位质量的所述样品的细菌的数量为：单位质量的所述样品中加入的所述第二定量DNA片段的分子数、测序所得的细菌的总拷贝数和所述样品的基因组DNA的总量的乘积，再除以测序所得的所述第二定量DNA片段的拷贝数、所述样品中的基因组DNA的得率和所述样品的质量的乘积。

本发明不用针对粪便样本进行流式细菌计数实验，极大节省了该方面的实验成本及时间。通过在提取后的粪便样本gDNA后加入sDNA2(已知序列、相对分子质量以及加入量，可得出其准确分子数)，不用针对该片段进行专门的qPCR实验进行定量，同样极大节省了该方面的实验成本及时间。另外，sDNA1和sDNA2片段均来自植物基因组，与细菌的参考基因组序列无同源性；此外，本发明的方法中采用的是宏基因组测序，获得的菌群数据信息相比16S测序更全面准确。

附图说明

图1示出了本发明的方法的流程的示意图。

图2示出了本发明的结果的计算方法的示意图。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。