[发明专利]一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测大豆根腐病的引物探针组合物、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测终极腐霉的引物探针组合物、试剂盒及其应用，该引物探针组合物由正向引物PuRPA‑F、反向引物PuRPA‑R和探针PuProbe组成，所述的正向引物PuRPA‑F具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，反向引物PuRPA‑R具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，探针PuProbe具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。与传统的依据形态特征来鉴定终极腐霉的检测技术相比，本发明具备更高的准确性、灵敏度和实效性，而且操作方便、实用性好，为终极腐霉的检测提供了新的技术平台，可用于终极腐霉引起的大豆根腐病的高灵敏度快速检测。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测由终极腐霉引起的大豆根腐病的引物探针组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

终极腐霉(Pythium ultimum)是一种常见的土传病原菌，也是最有致病力的腐霉属之一，能侵染大量的经济作物，包括小麦、玉米、大豆、马铃薯、番茄等。终极腐霉引起的大豆根腐病给大豆生产带来了严重的损失。因此，终极腐霉的分子检测对农业生产的作物病害的意义重大，快速准确的检测为病害的防治提供参考，有效利用最佳防治时期，降低损失。

腐霉菌的检测是病害防控的关键一步，传统的检测方法基于特定培养基上腐霉菌的微观形态和生长特性，耗费时间且需要经验丰富的实验人员。近些年来，基于核酸扩增技术的分子检测方法被广泛应用于植物病原物的检测，目前已经建立了多种植物病原腐霉菌的分子检测方法，主要是基于聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光定量PCR(real time PCR)等技术。但这些技术依赖于精密昂贵的温度循环装置，需要专业的技术人员和复杂的反应试剂，所需的检测时间仍然比较长。因此，建立一种简单、快速、灵敏、准确的方法来检测腐霉菌所致植物病害是至关重要的。该方法中筛选特异性强灵敏度高的引物组合物是检测终极腐霉的关键。

重组酶聚合酶扩增(RPA)技术是新发展的一种等温扩增技术，技术体系中主要是三种酶发挥作用，即结合寡核苷酸引物的重组酶、单链DNA结合蛋白和具有链置换活性的DNA 聚合酶。由于这三种酶在常温下具有活性，重组酶聚合酶扩增反应一般在37-42℃进行，这比LAMP反应的温度更低，反应条件更易实现，而且反应更加快速，一般反应20分钟就可以进行检测，是一种非常有潜力的分子检测工具。目前以RPA技术为基础的分子检测方法在人体医学、动物医学上的研究和应用较多，在植物病原菌分子检测方面的应用较少，因此围绕终极腐霉建立重组酶聚合酶扩增检测技术具备很大的潜力。

发明内容

针对现有技术中终极腐霉生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测终极腐霉的引物探针组合物、试剂盒及其应用。

本发明是通过以下技术方案实现上述的发明目的：

一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测终极腐霉的引物探针组合物，该引物探针组合物由正向引物PuRPA-F、反向引物PuRPA-R和探针PuProbe组成，所述的正向引物PuRPA-F具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，反向引物PuRPA-R具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，探针PuProbe具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。各引物和探针的序列如下所示：

正向引物PuRPA-F：TTCACGATGTATGGAGACGCTGCATTTAGTTG

反向引物PuRPA-R：Biotin-TCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAG

探针PuProbe：FAM-TATCATTGTCAATTGCAAGATTGTGTATGG-THF- ATCTCAATTGGACCT-C3 spacer

上述的引物探针组合物在制备用于检测终极腐霉的试剂盒中的应用。