[发明专利]华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒，该试剂盒包括根据华支睾吸虫细胞色素C氧化酶亚单位1基因COI基因设计的特异性引物及荧光探针。此外，本发明还公开了用于检测华支睾吸虫的引物和探针以及所述的引物和探针在制备感染华支睾吸虫疾病诊断产品中的应用。所述引物的上游引物为如SEQ ID NO.1所示序列；下游引物为如SEQ ID NO.2所示序列；所述探针为如SEQ ID NO.3所示序列。本发明成功建立了一种可高效检测、华支睾吸虫粪便DNA的高灵敏的检测试剂盒，快速、敏感和特异，可用于华支睾吸虫感染，尤其是轻度感染的检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种PCR检测试剂盒，尤其涉及一种华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒。 此外，本发明涉及华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒的应用。

背景技术

华支睾吸虫是一种重要的食源性疾病，最新调查显示，我国约有598万感染者，珠江三角洲城镇与城郊生态区、东北平原西部生态区及三江平原生态区的华支睾吸虫病呈高度流行状态，感染率分别为23.36%、9.44%和8.53%。食鱼生的饮食习惯是致流行区人群华支睾吸虫感染的主要危险因素。华支睾吸虫病可致275 370个伤残调整寿命年的损失，造成严重的经济负担。急性、严重感染会出现非特异性消化系统相关临床症状，如腹痛、腹泻、黄疸、胆囊炎、胆道纤维化、胆道结石等，慢性反复性感染会致肝胆管癌，2009年华支睾吸虫被国际癌症肿瘤机构列入Ι类致癌物。

目前华支睾吸虫的检测主要仍然依靠粪便镜检（改良加藤厚涂片法），该方法被认为是确诊华支睾吸虫感染依据的金标准，但其灵敏度不高，易出现漏诊、错诊，且需依赖检测人员的经验和镜检能力。近年来，随着分子生物学技术的发展，各种核酸检测方法用于华支睾吸虫感染的检测，如环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermalamplification，LAMP）、ELISA、PCR及实时荧光定量PCR，但这些检测方法受到样本核酸纯度、核酸抑制物或者抗体浓度等因素的影响而影响检测效率。中国发明专利CN201410676271公开了华支睾吸虫实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。而荧光定量PCR方法依赖标准品和标准曲线实现样本定量检测，但目前尚无法实现绝对定量。

ddPCR（液滴式数字PCR，Droplet digital PCR）是近几年发展起来的一种全新的核酸检测方法，其首先通过将微量DNA样本进行大量稀释，利用微流控技术产生大量的独立油包水乳化反应微滴，每个微滴不含有或含有一个至数个模板分子，通过PCR反应扩增，之后通过对每个微滴的荧光信号进行统计分析，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例定量DNA拷贝数。ddPCR方法不需要依赖标准品和标准曲线即可实现样本的绝对定量，且不易受到DNA样本中所含核酸抑制物或抗体浓度等因素的影响而影响检测效率。该方法在一定程度上弥补了以往PCR检测方法的不足，可实现低浓度核酸样本的高度灵敏和准确的绝对定量，检测敏感性更高。但是并非所有的基因对象检测都适用于ddPCR方法。目前尚未发现有采用ddPCR方法对华支睾吸虫检测的相关报道。本研究拟建立基于华支睾吸虫COI 基因的ddPCR检测试剂盒，为华支睾吸虫病的早期、快速诊断等提供技术储备，也为该病的防控提供技术支持。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一在于提供一种华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒。本发明以华支睾吸虫为研究对象，开发了一种快速，敏感，特异，高灵敏度的检测试剂盒。

本发明要解决的技术问题之二在于提供用于检测华支睾吸虫的引物和探针及其用途。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

在本发明的一方面，提供一种华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒，该试剂盒包括根据华支睾吸虫细胞色素C氧化酶亚单位1基因COI基因设计的特异性引物及荧光探针。

作为本发明优选的技术方案，所述特异性引物及荧光探针的序列如下：