[发明专利]一种利用响应曲面法优化玄参多糖硫酸酯化的工艺

权利要求书

1.一种利用响应曲面法优化玄参多糖硫酸酯化的工艺，包括以下步骤：

⑴样品制备：

将玄参的干燥根在50℃温度下烘干24h后粉碎至10目，按200g：6L的料液比加入去离子水浸泡1h，微沸煎煮2h，煎煮液过滤，药渣再煎煮一次，合并滤液；所述滤液经减压浓缩至350~450 mL后，得到浓缩液，该浓缩液中加入其体积4倍的无水乙醇，混匀，静置过夜，弃去上清，得到沉淀物；所述沉淀物中加入100 mL的去离子水溶解，过大孔树脂柱DM-130脱除色素，洗脱液经减压浓缩，Sevage法脱除蛋白，得到脱除色素和蛋白的玄参多糖提取液；所述脱除色素和蛋白的玄参多糖提取液经浓缩、冷冻干燥，得到玄参多糖粉末；

在所述玄参多糖粉末0.50 g中加入无水甲酰胺20 mL溶解，得25 mg/mL的玄参多糖甲酰胺溶液；将该溶液缓慢加入不同比例酯化试剂中，充分搅拌下于60℃~100℃不同的温度水浴加热，反应1~5 h的不同时间，得到反应液；所述反应液用质量浓度为40 %的NaOH溶液调节pH到中性，装入分子截留量1000的透析袋内，常流水下透析3 d；透析完成后的溶液经减压浓缩、冷冻干燥，即得对应于不同比例酯化试剂的玄参多糖硫酸酯粉末；所述酯化试剂是指将4℃下预冻2 h的吡啶4.0~6.0 mL，加入置于冰水浴中的三颈烧瓶中；取氯磺酸6.0~9.0 mL逐滴加入三颈烧瓶内，剧烈搅拌下使之与吡啶反应，30~40 min滴加完成；当无浓烟产生结束反应，即得淡黄色酯化试剂；

⑵用氯化钡-明胶比浊法测定样品取代度：

①标准曲线制作：

精密称取100.0 mg K₂SO₄，用1 mol/L的盐酸定容至100mL，制得1.0 mg/mL K₂SO₄标准溶液；分别取20μL、60μL、100μL、140μL、180μL、200μL的质量浓度为1.0 mg/mL的K₂SO₄标准溶液于试管中，用1 mol/L的盐酸补足200μL；依次加入质量浓度为3%的三氯乙酸3.8mL与质量浓度为0.5% 的BaCl₂-明胶溶液1mL；以1 mol/L的盐酸做空白，加样完成后的5~15min内于360nm波长下测定，记吸光度为A₁；以质量浓度为0.25%的明胶溶液代替BaCl₂-明胶溶液，同法测定记得吸光度A₂；以K₂SO₄标准溶液mg/mL为横坐标，吸光度值差A₁-A₂为纵坐标，绘制标准曲线；

②样品取代度的测定：

精密称量10mg硫酸酯化玄参多糖于试管中，加5mL的1 mol/L盐酸，90℃水浴水解5小时；水解完成后用盐酸补加至5 mL，得2 mg/mL硫酸酯化玄参多糖水解液；取200μL水解液于试管中，其余操作均与所述步骤①制作标准曲线相同，根据标准曲线查出K₂SO₄浓度；

⑶样品ABTS⁺清除率的测定：

a) ABTS⁺溶液的配制：称取10 mgABTS于试管中，加入2.6 mL的0.66 mg/mL的过硫酸钾溶液，充分混合，室温避光状态下反应16 h，以生成ABTS⁺；反应完成后以无水乙醇稀释，于734 nm下测定，至吸光度为0.7±0.02；

b) 样品清除率的测定：取硫酸酯化玄参多糖粉末2.5 mg溶解于5mL蒸馏水中，得0.5mg/mL样品溶液；精密移取样品溶液1 mL于试管中，加入稀释好的ABTS⁺溶液3mL，室温下避光反应1 h；反应结束后于734 nm波长下测定吸光度A₁，以无水乙醇代替ABTS⁺溶液，同法测定记吸光度为A_x；以蒸馏水代替样液做空白，同法测定，记吸光度为A₀；；计算ABTS⁺清除率（%）；

ABTS⁺清除率（%）= （A₁-A_x）/ A₀×100%；

⑷实验设计与统计分析：

①单因素试验：

依次改变反应温度、反应时间、酯化试剂比例进行单因素试验，用氯化钡-明胶比浊法测定所得的硫酸酯化玄参多糖中样品硫酸根浓度Cs按下式计算硫百分含量S%及取代度DS，每次处理重复3次：

S%=0.092 Cs×100%；

；

式中162是指单糖相对分子量，32是指硫原子质量分数，102是指单糖基中羟基被硫酸基取代后相对分子质量的增加值；

②响应面法优化设计：

根据单因素试验结果，以反应温度、反应时间、酯化试剂比例作为考察因素，以取代度和ABTS⁺清除率为考察指标，利用Design Expert 8.0.6软件根据Box-Behnken设计原则进行实验设计，以反应温度A、反应时间B、酯化试剂比例C为自变量，以取代度DS为响应值y、ABTS⁺清除率为响应值y´，建立多元二次回归方程：

y=1.21+8.925×10^-3A+0.047B+7.925×10^-3C+0.033AB-0.039AC+0.016BC-

0.14A²-0.061B²-0.099C²；

y´=（83.34+1.83A+1.81B+3.41C-0.9AB-1.85AC+3.23BC-9.18A²-3.58B²

-10.46C²）×100%；

⑸实验结果分析与优化：

利用Design Expert 8.0.6软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面及其等高线图。