[发明专利]一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法

说明书

本发明公开了一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法，针对现有分离蜜环菌方法存在分离材料受限、易染杂菌、菌株易退化等问题，而创新研究的一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法，包括箭麻预处理、组织分离、组织培养、内生真菌分离、纯化与保藏，经过分离纯化、继代培养的蜜环菌菌株在应用于生产前，需要与天麻进行栽培试验，栽培试验包括白麻+蜜环菌的无性栽培、天麻种子+萌发菌+蜜环菌的有性栽培。本发明实用性强，操作方便，应用这种方法能达到分离污染率低、分离出的蜜环菌菌株在天麻栽培中侵染性强且不易退化的效果。

技术领域

本发明属于蜜环菌分离技术领域，具体而言，涉及一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法。

背景技术

蜜环菌属真菌俗名榛蘑、苞谷菌，隶属于真菌界、担子菌亚门、伞菌纲、伞菌目、白蘑科。该属真菌在世界约有40种，在中国分布也较为广泛，华中、西南地区和东北地区均有分布。蜜环菌是名贵中药天麻和猪苓重要的共生菌，天麻95％的生长期间均需要蜜环菌以根状菌索的形式提供营养物质。有研究表明用不同来源的蜜环菌菌株伴栽天麻，天麻的产量和质量不同，同时优质的蜜环菌能够有效的提高天麻素含量。因此，选择与天麻亲和性高的蜜环菌菌种栽培天麻是保障天麻生产的关键因素之一。

分离纯化蜜环菌菌种，对获取种质资源以及开展育种工作都具有十分重要的意义，当前常用的分离方法中，子实体分离法由于人工栽培蜜环菌子实体较困难，野生材料难于获得；菌索及菌木分离法技术较为复杂，易染杂菌，操作难度大、成功率低；2006年，肖波等在《微生物学通报》上发表学术论文“蜜环菌菌种分离新法——天麻组织分离法”，利用蜜环菌菌索侵入白麻皮层组织，蜜环菌菌丝体穿插于白麻皮层及细胞间，所以分离材料采用了种麻的表皮组织，但此法存在分离材料受限(仅白麻皮层)、分离培养易染菌的问题，而且菌株性状不稳定高，往往分离当年的菌株活性表现良好，转接到第二、三代后，容易出现菌株退化现象。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法，本发明通过箭麻预处理、组织分离、组织培养、内生真菌分离、纯化与保藏，以此达到蜜环菌分离、不易染菌、保持种性稳定的目的。

为了实现所述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法，包括(1)箭麻预处理、(2)组织分离、(3)组织培养、(4)内生真菌分离、(5)纯化与保藏；

所述步骤(1)箭麻预处理：选取当年采集的进入停长期的商品天麻，用自来水冲洗30min，洗净泥沙，避免损伤天麻，再用无菌水将材料冲洗1～2次；

所述步骤(2)组织分离：用无菌解剖刀将箭麻切成1cm～2cm长的小段，用刀轻轻刮去表面，用无菌水反复冲洗2～3次，再以75％的酒精冲洗30s，取出后再用无菌水反复冲洗3～4次，在无菌滤纸上吸去表面水分，再置于0.1％升汞溶液浸泡消毒1min，再用无菌水清洗3～4次，用无菌吸水纸吸去表面水分，置于垫有无菌滤纸的表面皿上；

所述步骤(3)组织培养：用无菌解剖刀和镊子将天麻横切成0.5cm×0.5cm 的方形小块，接种于含有抗生素的改良PDA培养基的培养皿上，培养皿用报纸包好，16℃下暗培养3d，能够有效的减少霉菌的污染，再转移至24℃的培养箱中培养15d；

所述步骤(4)内生真菌分离：培养期间蒂除有颜色的杂菌，蜜环菌基内菌丝为白色网状分支，观察培养基内部是否有根状菌索伸出，若没有进行二次分离；待透明状或白色菌丝长出，且培养基内部是否有根状菌索伸出后，挑取菌丝于改良PDA培养基的试管中，置于24℃培养15d；

所述步骤(5)纯化与保藏：所得菌株均采用改良PDA培养基纯化，无菌条件下，挑取菌丝于改良PDA培养基的试管中，置于24℃培养15d，直至纯培养，每株菌备份5份，4℃保藏。