[发明专利]一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法

权利要求书

1.一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法，包括(1)箭麻预处理、(2)组织分离、(3)组织培养、(4)内生真菌分离、(5)纯化与保藏；

所述步骤(1)箭麻预处理：选取当年采集的进入停长期的商品天麻，用自来水冲洗30min，洗净泥沙，避免损伤天麻，再用无菌水将材料冲洗1～2次；

所述步骤(2)组织分离：用无菌解剖刀将箭麻切成1cm～2cm长的小段，用刀轻轻刮去表面，用无菌水反复冲洗2～3次，再以75％的酒精冲洗30s，取出后再用无菌水反复冲洗3～4次，在无菌滤纸上吸去表面水分，再置于0.1％升汞溶液浸泡消毒1min，再用无菌水清洗3～4次，用无菌吸水纸吸去表面水分，置于垫有无菌滤纸的表面皿上；

所述步骤(3)组织培养：用无菌解剖刀和镊子将天麻横切成0.5cm×0.5cm的方形小块，接种于含有抗生素的改良PDA培养基的培养皿上，培养皿用报纸包好，16℃下暗培养3d，能够有效的减少霉菌的污染，再转移至24℃的培养箱中培养15d；

所述步骤(4)内生真菌分离：培养期间蒂除有颜色的杂菌，蜜环菌基内菌丝为白色网状分支，观察培养基内部是否有根状菌索伸出，若没有进行二次分离；待透明状或白色菌丝长出，且培养基内部是否有根状菌索伸出后，挑取菌丝于改良PDA培养基的试管中，置于24℃培养15d；

所述步骤(5)纯化与保藏：所得菌株均采用改良PDA培养基纯化，无菌条件下，挑取菌丝于改良PDA培养基的试管中，置于24℃培养15d，直至纯培养，每株菌备份5份，4℃保藏。

2.根据权利要求1所述的一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法，其特征在于：所述改良PDA培养基：马铃薯(去皮)200.0g，玉米粉30.0g，葡萄糖20.0g，琼脂12.0g，KH₂PO₄5.0g，MgSO₄3.0g，蛋白胨5.0g，VB₁10.0mg，pH自然，加水定容至1000mL；分装至试管中，装液量为试管的2/3，高压灭菌后直立放置，待用。

3.根据权利要求1所述的一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法，其特征在于：所述含有抗生素的改良PDA培养基：在所述改良PDA培养基中添加氯霉素25μg/mL和链霉素10μg/mL，培养基经高温高压灭菌后，冷却至40℃～50℃左右添加氯霉素和链霉素，其中氯霉素的贮存液浓度为34mg/mL，链霉素的贮存液浓度为10mg/mL。

4.根据权利要求1所述的一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法，其特征在于：经过分离纯化、继代培养的蜜环菌菌株在应用于生产前，需要与天麻进行栽培试验，所述栽培试验包括白麻+蜜环菌的无性栽培、天麻种子+萌发菌+蜜环菌的有性栽培。

5.根据权利要求4所述的一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法，其特征在于：所述白麻+蜜环菌的无性栽培选择室内栽培，栽培用培养箱采用长×宽×高＝65cm×40cm×45cm的PP塑料培养箱，培养箱底部先铺层河沙，厚度5cm，放上栽培菌材，菌材之间间隔为6cm～8cm，放入培养好的蜜环菌三级种，保证菌材的截面与鳞口必须摆放蜜环菌，紧贴蜜环菌摆放白麻，盖上湿度为60％的河沙与木屑的混合物，厚度以完全覆盖菌材10cm为宜。

6.根据权利要求4所述的一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法，其特征在于：所述天麻种子+萌发菌+蜜环菌的有性栽培是在培养箱中铺5cm厚潮湿的河沙，将培养好的萌发菌栽培种撕开，均匀平铺于培养箱中，将天麻蒴果种子均匀的洒上后，拌匀，附上保鲜膜，保鲜膜用牙签均匀扎眼，便于透气，于24℃下培养3d～5d，待树叶表面变白，即可用于栽培种子。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的一种从箭麻内生真菌中分离蜜环菌的方法，其特征在于：温度控制在25℃以下，夏季最高不超过30℃，湿度控制在60％，管理期间不需要施肥和松土，秋季湿度控制在50％左右，冬季湿度在30％即可，生长期为8个月，产量统计以白麻重量表示。