[发明专利]一种含高拷贝数人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种含高拷贝数人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌及其应用，所述重组毕赤酵母工程菌是将SEQ ID NO.1所示溶菌酶基因以高拷贝数整合毕赤酵母基因组而获得。本发明采用两种质粒介导的重组菌构建方法，得到拷贝数为15的重组菌；重组菌产溶菌酶酶活高，120‑140h内发酵酶活180‑220KU/mL。

(一)技术领域

本发明涉及一种含有高拷贝数人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母及其发酵生产人源溶菌酶的应用。

(二)背景技术

溶菌酶是一种特异性作用于细胞壁的有效抗菌剂，破坏细胞壁的N-乙酰氨基葡糖和N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4-糖苷键，分解不溶性黏多糖为可溶性糖肽，具有溶菌作用。溶菌酶在自然界中来源广泛，可分为微生物、噬菌体、植物和动物四种类型的溶菌酶，其中动物溶菌酶活性高，应用广泛。1992年FAO/WTO的食品添加剂协会公布:溶菌酶应用于食品工业中是安全的，我国卫生部2010年第23号公告批准溶菌酶等物质为食品添加剂。溶菌酶的化学本质为蛋白质，在人及动物的胃肠内可以被消化、吸收。因此不会在体内残留，无毒性，安全性很高，在药品、饲料和食品等行业具有广泛的应用前景。在食品工业中可应用于水产品、乳制品、果蔬、肉类、酒及饮料的防腐保鲜。在畜牧业，溶菌酶可用作饲料防腐剂和杀菌剂。在医学上溶菌酶可以代替抗生素作为抗菌消炎的药物。

溶菌酶是一种碱性球蛋白，等电点为10.7-11.3，相对分子量为14.3kDa，最适pH6-7，最适温度50℃，分子中有4个二硫键。目前，溶菌酶主要从鸡蛋清和蛋壳膜中提取。但这种直接提取的生产方式，其规模小、成本高，不利于大规模化生产与应用。特别是，随着饲料用的抗生素的管理不断加强，溶菌酶的市场需求正快速扩大。利用基因工程技术构建溶菌酶大肠杆菌表达系统和酵母表达系统，可对溶菌酶进行异源表达和微生物发酵生产，已成为溶菌酶生产技术研究的热点。目前在溶菌酶工程菌构建方面申请的专利较多，包括蛋清溶菌酶(CN101050467B、CN104263709A、CN104694559A、CN105039189B、CN104946675A)、人源溶菌酶(CN1325958、CN1300852A、CN1289678C、CN1664096A、CN102229939B、CN104278017A、CN109295033A、CN109295088A)、猪源溶菌酶(CN107236681A、CN105861468A、CN106046173A)等。为了提高溶菌酶的表达能力，本发明将通过两种整合型质粒，携带人工组装的多拷贝人源溶菌酶基因表达读码框，整合到毕赤酵母基因组，挑选多拷贝整合工程菌株，构建人源溶菌酶的高拷贝数整合的毕赤酵母工程菌。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种含高拷贝数人源溶菌酶基因的毕赤酵母工程菌，实现发酵法高效生产人源溶菌酶。

本发明采用的技术方案是：

第一方面，本发明提供一种含高拷贝数人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌，所述重组毕赤酵母工程菌是将SEQ ID NO.1所示的来源于Homo sapiens人源的经过密码子优化的溶菌酶基因，以高拷贝数整合毕赤酵母基因组而获得。所述毕赤酵母优选毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，所述的毕赤酵母工程菌记为重组毕赤酵母工程菌(Pichiapastoris)IEF-hlyz15。

进一步，所述高拷贝数是指蛋清溶菌酶基因的拷贝数为15。

进一步，本发明所述人源溶菌酶基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，NCBI数据库登入号GenBank Protein ID：P61626。

本发明重组毕赤酵母工程菌(优选Pichia pastorisIEF-hlyz15)的构建方法，包括以下步骤：

1)通过基因合成公司合成密码子优化的人源溶菌酶基因，其核苷酸序列SEQ IDNO.1，并将其克隆到分泌型表达质粒pPIC9K上，获得重组质粒pPIC9K-hlyz，图1所示；