[发明专利]一种含高拷贝数人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌及其应用

权利要求书

1.一种含高拷贝数人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述重组毕赤酵母工程菌是将SEQ ID NO.1所示溶菌酶基因以高拷贝数整合毕赤酵母基因组而获得。

2.如权利要求1所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述毕赤酵母为毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。

3.如权利要求1所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述高拷贝数是指蛋清溶菌酶基因的拷贝数为15。

4.如权利要求1所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述人源溶菌酶基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

5.如权利要求1所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述重组毕赤酵母工程菌的构建方法包括以下步骤：

1)将SEQ ID NO.1所示人源溶菌酶基因克隆到分泌型表达质粒pPIC9K上，获得重组质粒，记为重组质粒pPIC9K-hlyz；

2)将重组质粒pPIC9K-hlyz采用限制性内切酶SacI线性化后，转化毕赤酵母菌株中，筛选得到拷贝数为5的高活性的重组菌株，记为重组菌株HC243；

3)将重组质粒pPIC9K-hlyz上的人源溶菌酶基因表达阅读框克隆到pPICZαA质粒上，并构建含有5个拷贝数的重组表达质粒，记为重组表达质粒pPICZα-hlyzV；

4)将重组表达质粒pPICZα-hlyzV采用限制性内切酶SalI线性化后，转化重组菌株HC243，筛选拷贝数为15的高活性的重组菌株，记为重组菌株IEF-hlyz15。

6.一种权利要求1所述重组毕赤酵母工程菌在发酵制备溶菌酶中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述发酵方法如下：(1)将重组毕赤酵母工程菌划线到YPD平板上，25-30℃培养40h；将单菌落接种到种子培养基中，25-30℃，100-250rpm培养至对数生长中期，获得种子液；所述YPD平板组成如下：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖10g/L、琼脂粉15g/L，溶剂为去离子水，pH自然；所述种子培养基终浓度组成：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖10g/L，溶剂为去离子水，pH7.0；

2)发酵培养：将种子液以体积1-10％的接种量接种到发酵培养基中进行甘油批次发酵，温度25-30℃，溶解氧DO大于20％，发酵18-24h至甘油耗尽；开始进入甘油补料发酵阶段：甘油补料培养基的补加速率为18-20mL/h/L起始发酵液体积，在温度25-30℃、搅拌速率200～900rpm、通气量为2～4L/min/L起始发酵培养基条件下发酵4-6h，发酵过程控制搅拌转速与溶解氧DO值偶联，控制DO值大于20％，甘油再次耗尽后继续饥饿培养1-2h；进入甲醇诱导发酵阶段，控制甲醇补料培养基的补料速率为3.0-3.6mL/h/L起始发酵培养基，维持溶解氧DO大于10％，发酵2-3h，提高甲醇补料培养基的补料速率为5.0-7.2mL/h/L起始发酵培养基，发酵3-5h后，继续增加甲醇补料培养基的补料速率为9.0-10.2mL/h/L起始发酵培养基，持续发酵110-120h，发酵结束，获得含溶菌酶的发酵液；所述发酵培养基质量终浓度组成：26.7ml/L的85％磷酸，0.93g/L的硫酸钙，18.2g/L的硫酸钾，14.9g/L的MgSO₄·7H₂O，4.13g/L的氢氧化钾，40g/L的甘油，4.35ml/L PTM1缓冲液，溶剂为去离子水，pH5.0；所述的甘油补料培养基是向质量浓度25％甘油中添加12ml/L PTM1缓冲液；所述甲醇补料培养基是向无水甲醇中添加12ml/L PTM1缓冲液；所述PTM1缓冲液组成：6.0g/L CuSO₄·5H₂O，0.08g/L的碘化钠，3.0g/L MnSO₄·H₂O，0.2g/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.02g/L硼酸，0.5g/L氯化钴，20.0g/L氯化锌，65.0g/L FeSO₄·7H₂O，0.2g/L生物素，5.0ml/L硫酸，溶剂为去离子水。