[发明专利]一种检测血液中地高辛的方法

权利要求书

1.一种检测血液中地高辛的方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(一)标准溶液的标定

(a)制备地高辛标准储备液

精确称取地高辛标准品2.0mg置于7mL冻存管，用含水量为0％-30％的甲醇溶液进行溶解，并定容于2mL，得到地高辛标准储备液，在-80℃条件下保存；

(b)制备地高辛的标准中间液

用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释上述地高辛标准储备液，制成含有浓度为4ng/mL～200ng/mL的地高辛的至少三种地高辛的标准中间液，并在-80℃条件下保存；

(c)制备内标工作液

用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释地高辛-d3储备液，得到一种含有10～100ng/mL地高辛-d3的内标工作液，并在-80℃条件下保存；

(d)制备标准溶液

分别移取10μL上述至少三种浓度的地高辛标准中间液，在上述每一种地高辛标准中间液中分别加入10μL的内标工作液和190μL的空白血清，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，再加入1mL甲基叔丁基醚萃取液，并在转速为2000～4000rpm下涡旋混匀5～10min，以达到充分萃取的目的，再在转速为10000～15000rpm下离心10min，得到上清液，取上清液用氮气缓慢吹干，并加入100μL复溶液混匀超声1min，在转速为10000～15000rpm下离心3min，取上清液制成至少三种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；

(e)拟合标准曲线方程

利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到至少三种不同浓度的标准溶液的地高辛和地高辛-d3的图谱；从上述每种浓度的标准溶液的图谱中分别得到地高辛的色谱峰峰面积和地高辛-d3的色谱峰峰面积，分别以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的地高辛的色谱峰峰面积与地高辛-d3的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y₁，以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的地高辛的浓度与地高辛-d3的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x₁，将上述检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到地高辛对应的标准曲线方程为：y₁＝a*x₁+b，并且得到权重系数a和b；

(二)待测血液样本的处理

取待测血液至少2mL，在离心速度3500rpm下离心10min，提取待测血液的上清液，并在-20℃条件下保存；

移取步骤(c)的地高辛-d3的内标工作液10μL于1.5mL离心管中，再加入上述待测血液的上清液200μL，在1000rpm的转速下涡旋震荡混合30s，然后再在上述离心管中加入1mL的甲基叔丁基醚萃取液，在3000rpm的转速下涡旋震荡混合8min，以达到充分萃取的目的，再在10000-15000rpm的转速下高速离心10min，得到上清液，取上清液1mL用氮气缓慢吹干，并加入100μL复溶液混匀超声1min，在转速为10000～15000rpm下离心3min，得到上清液即为待测血液样本；

(三)待测血液样本的检测

利用液相色谱-质谱联用仪检测上述待测血液样本，得到待测血液样本中的地高辛的色谱峰峰面积和地高辛-d3的色谱峰峰面积；将待测血液样本中的地高辛的色谱峰峰面积与地高辛-d3的色谱峰峰面积的比值作为y₁，代入步骤(e)得到的y₁＝a*x₁+b公式中，计算得到待测血液样本中的地高辛的浓度与地高辛-d3的浓度的比值x₁，由于上述待测血液样本中地高辛-d3的浓度为已知，由此计算出待测血液样本中的地高辛浓度。

2.如权利要求1所述的检测血液中地高辛的方法，其特征在于：在步骤(b)中，制备七种含有不同浓度地高辛的标准中间液，它们分别是含有4、8、16、32、64、128、200ng/mL地高辛浓度的标准中间液。

3.根据权利要求2所述的检测血液中地高辛的方法，其特征在于：在步骤(b)中，所述甲醇稀释液为含水量30％甲醇溶液，在步骤(a)中，用纯甲醇溶解地高辛标准品。