[发明专利]鼻咽癌相关基因DACT1、NFAT1、SHISA3甲基化检测试剂盒

说明书

本发明提供了一种鼻咽癌相关基因DACT1、NFAT1和SHISA3甲基化检测试剂盒，所述试剂盒包括碱性溶液、荧光PCR反应液，所述碱性溶液和所述荧光PCR反应液被热熔材料分层包装在同一PCR扩增管内；所述碱性溶液为pH值为12.5～13.3、浓度为50～100mmol/L的NaOH溶液，其体积不超过PCR反应液体积的50％；所述荧光PCR反应液包括针对DACT1、NFAT1、SHISA3基因的引物及探针和UDG酶。本发明通过在荧光PCR反应前进行分体系、分步热处理，有效地应用了UDG酶，有效地解决了甲基化检测中的PCR污染问题，并具有较高的检测灵敏度和特异性以及较高的检测通量。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鼻咽癌相关基因DACT1、NFAT1、SHISA3甲基化的检测试剂盒。

技术背景

鼻咽癌是一种起源于鼻咽上皮的恶性肿瘤，具有很强的局部侵袭性并可产生远处转移，其在中国南部和东南亚地区的发病率较高(Torre LAet al.,CACancer J Clin,2015,65,87-108)。近年来调强放疗和化疗的应用大大改善了鼻咽癌的预后，尤其是早期鼻咽癌的预后，但仍有约30％的鼻咽癌患者最终发展为复发和/或远处转移(Lai SZ et al.,Int J Radiation Oncology Biol Phys,2011,80,661-668)。因此，鼻咽癌治疗的主要挑战仍然是缺乏有效的生物标志物来开发更精确的诊断、预后、治疗和预防方法。

与其他类型的癌症一样，鼻咽癌与多种基因突变和表观遗传异常有关；其中，启动子CpG岛的异常DNA甲基化是鼻咽癌发展和进展的基础(Jiang W et al.,Asian Pac JCancer Prev,2015,16,8059-8065)。在鼻咽癌上皮细胞中，许多基因主要被DNA甲基化沉默。因此，DNA甲基化差异基因的鉴定有助于了解其发病机制，为鼻咽癌的早期诊断、鼻咽癌的复发/转移、鼻咽癌的优化和个性化治疗提供有效的生物标志物。

DACT1是一种肿瘤相关基因，其在调节肿瘤细胞生长、增殖、侵袭和转移中具有重要作用(Cheyette BNR,et al.,Developmental Cell,2002,2,449-461)。DACT1基因包含6个外显子，定位于人类染色体14q23.1。最近研究发现，DACT1基因在71％的鼻咽癌患者中高度甲基化，且在淋巴结转移鼻咽癌患者中，DACT1基因甲基化发生率更高，达84％(Yang JHet al.,Biological Research,2019,52,31)。进一步研究发现，DACT1基因甲基化可能下调DACT1表达，从而促进鼻咽癌细胞的侵袭和转移(Yang JH et al.,Biological Research,2019,52,31)。以上研究表明，DACT1基因甲基化可能是今后鼻咽癌进展和预后的重要指标。

NFAT1也被称为NFATC2、NFATP，是活化T细胞核因子家族成员之一。它通过调节细胞周期相关蛋白的表达调控细胞转化，通过逆转肿瘤细胞的转化表型发挥肿瘤抑制作用。该基因包含13个外显子，定位于人类染色体20q13.2。一项全基因组微阵列数据显示，NFAT1是鼻咽癌组织中甲基化程度最高的转录因子基因之一(Ren X et al.,NatureCommunications,2017,8,14053)。与正常组织、正常鼻咽上皮细胞系相比，鼻咽癌组织、鼻咽癌细胞系中NFAT1甲基化水平明显更高(Zhang J et al.,Neoplasia,2019,21,311-321)。在鼻咽癌中，NFAT1启动子甲基化导致NFAT1表观遗传沉默，而NFAT1表观遗传沉默通过激活ITGA6转录从而促进鼻咽癌上皮-间质转化和转移(Zhang J et al.,Neoplasia,2019,21,311-321)。可见，NFAT1基因甲基化或可作为鼻咽癌转移/进展的一个潜在生物标志物。