[发明专利]同时检测CSFV、PPV、JEV、PRRSV抗体的荧光标记蛋白芯片制备和检测方法

说明书

本发明涉及一种检测CSFV、PPV、JEV、PRRSV抗体的Cy3标记蛋白芯片、试剂盒及检测方法。所述芯片载体为环氧基修饰的光学级玻片，其成本较低，适合产业化大规模购买和生产。本发明通过原核表达获得目的抗原，将蛋白通过晶芯Personal Arrayer 16接触式点样系统点制芯片，其特征在于每个基片至少包含一个检测区，每个检测区至少包含5个检测亚区，分别为CSFV、PPV、JEV、PRRSV、检测区及2％BSA阴性对照区。检测结果通过博奥Luxscan‑10K/A芯片扫描仪读取荧光值，在临床使用中，本发明具有特异性高、灵敏性强、能高通量检测的优点。

技术领域

本发明涉及分子生物学、免疫分析学等技术领域，尤其涉及同时检测CSFV、PPV、JEV、PRRSV抗体的Cy3标记蛋白芯片的制备方法和检测方法。

背景技术

近几十年，生命科学研究经历着一个以高通量为特点的大规模新兴技术研发与应用的阶段，开启了基于高通量的数据收集与分析的时代。随着生物研究的深入，人们认识到基因水平的研究对揭示复杂的生物现象已经是远远不够的，蛋白质才是生命活动的最终执行者，随着蛋白质组学的发展，微阵列芯片技术也引起了人们的广泛关注。

蛋白质芯片是一种将已知蛋白分子(Capture molecular)固定在芯片基质上的检测方法，从混合样品中捕捉目标分子，再用抗体对目标分子进行检测或标记，从而检测得知哪些被测样品中含有与已知蛋白分子结合的目标分子。其原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上(如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等)，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白(存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等)，经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析；它为获得重要生命信息(如未知蛋白组分、序列。体内表达水平生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等)提供有力的技术支持。

蛋白芯片作为新型的实验室检测技术，因其制备成本较高，在动物疫病诊断的研究并不广泛，也没有用于检测动物传染病相应成熟的检测产品问世。石霖等制备得到的可目视化诊断蛋白芯片，可以同时鉴别诊断禽流感(AI)、新城疫(ND)2种禽病的血清抗体，其灵敏度是琼扩(AGP)抗体检测方法的400倍以上；Wang等建立了一种可区分禽流感(AI)、新城疫(ND)、鸡传染性支气管炎(IB)、传染性法氏囊病(IBD)4种禽病的可视化蛋白芯片，其灵敏性明显高于传统检测方法；Xu等利用新型固体材料iPDMS作为固相载体，建立了一种新型蛋白质芯片用于检测蓝舌病毒，该方法有高度的灵敏度和特异性，并与商业化的IDEXX BTVELISA试剂盒比较，其总符合率、阴性符合率和阳性符合率分别为95.12％，99.28％和86.5％；纪方晓等将纯化的猪戊型肝炎ORF2原核表达重组蛋白作为抗原，建立液相蛋白芯片检测方法，这种方法批内、批间变异系数小，该方法与商品化ELISA试剂盒比较的符合率为93.1％。

猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的猪瘟导致猪群高热性和高度接触性死亡，致使我国及全世界养猪业经济损失严重。我国现阶段正在加紧猪瘟净化的步伐，血清学检测是猪瘟防控免疫效果评估重要技术手段，也是猪瘟净化计划最后阶段必要实施的检测方法。目前常用的猪瘟抗体检测方法，其中NPLA、FAVN和ELISA是国际贸易中指定诊断方法。其中ELISA以其简便、已操作等优点被广泛用于临床检验，但ELISA检测抗体所需样本量较多，且不能同时检测多种疾病。结构蛋白E2是主要的保护性抗原，具有良好的免疫原性，能诱导机体产生中和抗体，因而是建立疾病诊断方法的首选蛋白。蔺辉星等以纯化的截短E2蛋白为包被抗原,优化间接ELISA反应条件,建立了检测CSFV血清抗体的间接ELISA，为CSFV血清抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。但此方法每个临床样本至少需要100ul，且只能检测猪瘟单一抗体。目前还没有以Cy3荧光标记蛋白芯片的方法检测猪瘟抗体的报道。