[发明专利]同时检测CSFV、PPV、JEV、PRRSV抗体的荧光标记蛋白芯片制备和检测方法在审

申请号：	201911097381.9	申请日：	2019-11-11
公开（公告）号：	CN110702925A	公开（公告）日：	2020-01-17
发明（设计）人：	周斌;吴月;吴许丹;陈婧	申请（专利权）人：	南京农业大学
主分类号：	G01N33/68	分类号：	G01N33/68;G01N33/569;G01N33/533;G01N21/64
代理公司：	32218 南京天华专利代理有限责任公司	代理人：	徐冬涛;竞存
地址：	211225 江苏省南京市溧***	国省代码：	江苏;32
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摘要：
搜索关键词：	检测区读取高通量检测环氧基修饰芯片扫描仪蛋白芯片点样系统检测结果芯片载体阴性对照原核表达产业化光学级接触式灵敏性试剂盒种检测检测抗原荧光玻片点制晶芯抗体亚区蛋白芯片购买生产
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【权利要求书】：

1.一种同时检测CSFV、PPV、JEV、PRRSV抗体的Cy3标记蛋白芯片制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

S1：截取CSFV-E2、JEV-EDIII、PRRSV-N基因特异性抗原表位，分别将CSFV-E2、JEV-EDIII、PRRSV-N基因特异性抗原表位、PPV-VP2基因序列，克隆至pET-32a原核表达载体，转化至DH5α感受态细胞进行扩增，构建得到重组表达质粒pET-32a-E2、pET-32a-EDⅢ、pET-32a-N、pET-32a-VP2；

S2：鉴定正确的重组质粒pET-32a-E2、pET-32a-VP2、pET-32a-EDⅢ、pET-32a-N分别转化至大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导，离心分离上清和包涵体，对包涵体进行洗涤、溶解、过滤后用His标签高亲和力Ni柱纯化，得到目的蛋白CSFV、PPV、JEV、PRRSV，BCA蛋白定量试剂盒测定浓度后-80℃保存；

S3：将S2制得的重组蛋白CSFV、PPV、JEV、PRRSV稀释后，点样在芯片载体上，所述载体为环氧基片，经水合、干燥、封闭、洗涤制得检测CSFV、PPV、JEV、PRRSV抗体的Cy3标记蛋白芯片，储存备用；优选的，所述储存条件为4℃。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中，所述CSFV-E2基因特异性抗原表位为GenBank:FJ598612.1，193-530bp处，JEV-EDIII基因特异性抗原表位为GenBank:LC095865.1，849-1304bp处，PRRSV-N基因特异性抗原表位为GenBank:KM252867.1，1-372bp处，PPV VP2基因序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中，所述IPTG诱导浓度为0.2mM，诱导条件为37℃，5h。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S3中，制备的蛋白芯片至少包含一个检测区，每个检测区至少包括CSFV蛋白检测亚区、PPV蛋白检测亚区、JEV蛋白检测亚区、PRRSV蛋白检测亚区，2％BSA阴性对照亚区。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S3中所述稀释为，将S2制得的重组蛋白CSFV、PPV、JEV、PRRSV分别稀释至0.025mg/ml-0.4mg/ml；

优选的，所述稀释为将CSFV稀释至0.2mg/ml，将PPV稀释至0.4mg/ml，将JEV稀释至0.4mg/ml，将PRRSV稀释至0.4mg/ml；

更优选的，稀释所用蛋白稀释液为含博奥点样液的PBS；

更进一步优选的，稀释所用蛋白稀释液为含50vol％的博奥点样液的PBS；

所述点样方式为晶芯Personal Arrayer 16接触式点样系统；

所述水合条件为37℃水合10h以上，优选的，水合条件为37℃水合10h；

所述封闭方法为2％BSA封闭2h；

所述洗涤方法为PBST，洗涤5min；

各检测样本间通过凸起的围栏进行隔离。

6.采用权利要求1至5任一项所述的同时检测CSFV、PPV、JEV、PRRSV抗体的Cy3标记蛋白芯片检测方法制备得到的同时检测CSFV、PPV、JEV、PRRSV抗体的Cy3标记蛋白芯片。