[发明专利]一锅法生产莱鲍迪苷D的方法

说明书

本发明公开了一锅法生产莱鲍迪苷D的方法，包括如下步骤：构建能分泌表达糖基转移酶UGT1的重组菌1，所述糖基转移酶UGT1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；在pH3.5‑7.8的培养基中培养重组菌1,得到培养液；在培养液中加入底物莱鲍迪苷A，加入尿苷二磷酸葡萄糖，硫酸镁或氯化镁，甲醇，反应，得到莱鲍迪苷D。本发明的一锅法生产莱鲍迪苷D在重组菌1发酵生成糖基转移酶UGT1的同时可催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷D，无需纯化UGT1和离心分离就能获得莱鲍迪苷D的。本发明的方法简单、高效、可以降低分离糖基转移酶UGT1的生产成本，可以商业化获得甜度高、口感好、高价值的莱鲍迪苷D。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地涉及一种一锅法生产莱鲍迪苷D的方法，包括构建能分泌UGT1表达的重组菌1、重组菌1的培养及无需分离纯化直接加入底物RA生成RD的方法。

背景技术

甜菊糖苷是一种从菊科草本植物甜菊叶中精提的新型天然低热量甜味剂甜菊糖苷类化合物因其甜度高、热量低、无毒性、耐高温、耐酸碱和水溶性好等优点，被美国食品药品监督管理局认证为安全，可应用于食品行业。莱鲍迪苷D(Rebaudioside M，RD)具有更好的口感特性，但甜菊中仅含约0.5％，导致分离成本高、价格昂贵。生物催化法获得高浓度的RD已引起了学者的关注。目前报道，来源甜菊的重组酶能催化RA生成RD，但产量较低、费用高。

以RA为底物、通过生物催化法可获得RD，但其生物催化过程中，目前主要有以下几种问题：(1)生物催化需要高效的糖基转移酶，在植物中糖基转移酶含量很低，远达不到实际应用的水平，而且难于分离纯化；(2)重组糖基转移酶能催化产物RD的生成、但胞内表达生产的重组酶需要离心收集菌体破胞等过程才能进行催化，步骤繁琐；(3)在反应过程中，由于热抑制作用，UGT酶的大部分活性会丧失。因此，高效生物催化获得RD需要能高效、简单、低成本的技术^[3]。

由于天然糖基转移酶产量很低，难于分离纯化。胞内表达生产糖基转移酶需要收集菌体及破胞等繁琐的过程。如果通过构建重组菌株，分泌生产糖基转移酶，采用培养重组菌培养过程中直接投料底物RA实现RD的生成，将会减少RD生成的工艺步骤、降低生产成本、是RD工业化规模生成的可行途径。

参考文献：

[1]费理文,王勇.甜味剂莱鲍迪苷D的高效生物催化合成[J].食品与发酵工业,2018,44(4):1-7.

[2]杨玉凤,费理文,李建华,等.重组大肠杆菌全细胞催化合成莱鲍迪苷D[J].工业微生物,2017,47(5):1-7.

[3]王振宇，鱼红闪，金风燮.高温厌氧菌产纤维素内切酶和争葡萄糖苷酶的活性.大连轻工业学院学报，2005，24(2)，110～l14.

[4]关瑾.甜味剂的应用现状及发展前景[J].当代化工,2002,31(2):89-91.

郑建仙.功能性食品添加剂[M].北京:中国轻工业出版社,1997.

[5]唐志发.甜菊糖的崛起与发展战略[J].中国食品工业,1999,(2):52-52.

[6]胡国华.复合食品添加剂[M].北京:化学工业出版社,2006.

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种一锅法生产莱鲍迪苷D的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一锅法生产莱鲍迪苷D的方法，包括如下步骤：

(1)构建能分泌表达糖基转移酶UGT1的重组菌1，所述糖基转移酶UGT1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)在pH3.5-7.8的培养基中培养重组菌1,培养0.2-2天，得到培养液；