[发明专利]一种鉴别龙血树品种的PCR方法

说明书

本发明公开了一种鉴别龙血树品种的PCR方法，包括：提取基因组DNA和总RNA、反转录、基因克隆、转化、测序、比对的过程，其中，PAL‑F：5’‑GCCTAAACAAGACAGGTACGCC‑3’，如SEQ ID NO.1所示；PAL‑R:5’‑GCAAGGGTCGTCAATGTAGGTG‑3’，如SEQ ID NO.2所示。本发明根据龙血树PAL基因序列设计同源克隆引物，克隆剑叶龙血树、海南龙血树和岩棕等3种龙血竭基源植物的PAL基因序列，分析3种龙血树PAL的差异，发现了3种龙血树的分子鉴定方法，为不同来源的龙血竭原料鉴定提供了参考。

技术领域

本发明涉及基因克隆与分子鉴定技术领域，更具体地说是涉及一种鉴别龙血树品种的PCR方法。

背景技术

百合科(Liliaceae)龙血树属(DracaenaVand.Ex L.)植物主要分布于亚洲和非洲的热带和亚热带地区，其寿命可达数千年。根据《中国植物志》记载全球约有40余种龙血树，在中国云南、广东、广西、海南和台湾等地分布有8种，分别为剑叶龙血树[D.cochinchinensis(Lour)S.C.Chen]、海南龙血树[D.cambodiana]、长花龙血树[D.angustifolia Roxbv]、细枝龙血树[D.marginata]、矮龙血树[D.thalioides]、深脉龙血树[D.impressivenia]、河口龙血树[D.hokouensis]和勐腊龙血树[D.menglaensis]。

利用剑叶龙血树和海南龙血树分泌的红色树脂可提炼一种传统名贵中药-龙血竭(dragon’s blood)，现代药理研究表明，龙血竭具有抗炎、镇痛、抗氧化、增强免疫力、促进血液循环、调节机体新陈代谢等多种活性，其良好的临床疗效引起了国内外学者的关注和重视，李时珍在《本草纲目》中誉其为“活血圣药”；岩棕分泌的树脂亦可作为提炼龙血竭的原料。野生龙血树需生长数十年才能用来生产龙血竭，是国家重点保护的濒危植物；国内现有的龙血竭原材料主要来自老挝、越南、柬埔寨等东南亚国家的野生龙血树，但是其基源植物种类不易分辨。

因此，如何提供一种鉴别龙血树树种的方法，从而鉴别龙血竭的直接来源是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明根据龙血树PAL基因序列设计同源克隆引物，克隆剑叶龙血树、海南龙血树和岩棕等3种龙血竭基源植物的PAL基因序列，分析3种龙血树PAL的差异，发现了3种龙血树的分子鉴定方法，为不同来源的龙血竭原料鉴定提供了参考。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鉴别龙血树品种的PCR方法，包括下述步骤：

1)提取基因组DNA和总RNA；分别对3种龙血树的基因组提取DNA和RNA；

2)反转录：将步骤1)得到的总RNA反转录得到cDNA；

3)基因克隆：利用PAL-F和PAL-R引物对步骤1)得到的3种基因组DNA和cDNA进行扩增，电泳并回收目的基因；

4)转化、测序：将步骤3)得到的目的基因转化至大肠杆菌DH5α，将阳性克隆进行测序；

5)比对：根据测序结果，比对三种PAL基因序列的差异；

其中，PAL-F：5’-GCCTAAACAAGACAGGTACGCC-3’，如SEQ ID NO.1所示；

PAL-R:5’-GCAAGGGTCGTCAATGTAGGTG-3’，如SEQ ID NO.2所示。

作为本发明优选的技术方案，步骤1)中，以Plant Genomic DNA Kit试剂盒提取剑叶龙血树、海南龙血树和岩棕的基因组DNA。