[发明专利]一种基于同步光源的X-射线多色遗传标记探针及其制备方法以及应用

说明书

本发明提供一种基于同步光源的X‑射线多色遗传标记探针及其制备方法以及应用，包括：1)构建至少两种同时包括酶和目的蛋白的融合表达质粒，并将其同时转染进细胞；2)使用戊二醛固定液冰浴固定所述细胞；3)加入第一DAB‑金属络合物，冰浴反应；4)去除反应液，加入封闭液；5)加入第二DAB‑金属络合物，冰浴反应；6)若构建三种及三种以上融合表达质粒，则重复上述步骤4)，5)；7)去除反应液，固定细胞；以及8)同步X射线成像观察，每种DAB‑金属聚合物在X射线下具有特异性的荧光峰，即得。根据本发明，提供了一种能同时对细胞内多种生物分子进行高特异性识别和高分辨率成像的方法，具有良好的生物医学应用前景。

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，更具体地涉及一种基于同步光源的X-射线多色遗传标记探针及其制备方法以及应用。

背景技术

显微成像技术是细胞生命科学发展的主要推动力之一。细胞的每一项生理活动均是一个复杂的生物学过程，涉及多种蛋白分子之间的相互作用及其定位变化。这在客观上要求研究细胞成像的技术能够同时对多个生物分子发出的信号进行获取与成像，从而对生命过程做出完整的阐述。基于同步X射线的显微技术在细胞成像领域具有独特的优势。由于X射线的波长在0.1-10nm范围内，因此其天然就是一种超分辨显微成像技术，分辨率理论上能够达到数个纳米。另外，与电子束相比，X射线对生物样品的穿透力更强，因此不需要经过切片等处理就能对完整细胞进行成像。更重要的是，X射线显微成像技术对不同元素具有独特的X射线荧光特征谱且互不干扰。因此，结合X射线敏感的成像探针，能够实现同时对细胞内多种生物分子的高分辨识别和成像。

我们之前的专利中，发展了一种基于同步光源的X-射线遗传标记探针，应用于对细胞内特定生物分子进行识别并成像。但是，如何同时对多种感兴趣的生物分子进行标记仍是一大瓶颈。因此，现阶段开发同步X射线多色成像探针，实现同时对细胞内多种生物分子的精确识别和定位具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于同步光源的X-射线多色遗传标记探针及其制备方法以及应用，从而解决现有X射线显微技术还无法对细胞内多种生物分子同时进行识别和定位的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种基于同步光源的X-射线多色遗传标记探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：1)构建至少两种同时包括酶和目的蛋白的融合表达质粒，并将所述至少两种融合表达质粒同时转染进细胞，所述细胞表达至少两种不同的融合蛋白；2)使用戊二醛固定液冰浴固定所述细胞；3)加入针对第一种融合蛋白的第一DAB-金属络合物，冰浴反应，使所述第一种融合蛋白催化第一DAB-金属络合物发生聚合；4)去除反应液，加入封闭液；5)加入针对第二种融合蛋白的第二DAB-金属络合物，冰浴反应，使所述第二种融合蛋白催化第二DAB-金属络合物发生聚合；6)若构建三种及三种以上同时包括酶和目的蛋白的融合表达质粒，则重复上述步骤4)，5)，直至所有融合蛋白催化相应的DAB-金属络合物发生聚合；7)去除反应液，使用固定液固定细胞；以及8)将所述细胞滴加在同步成像基底上，同步X射线成像观察，每种DAB-金属聚合物在X射线下具有特异性的荧光峰，即得一种基于同步光源的X-射线多色遗传标记探针。

根据本发明所提供的制备方法，其工作原理为：质粒在细胞内同时表达不同的酶与蛋白的融合蛋白，构建同时包括酶和目的蛋白的多种融合表达质粒，并将所述多种融合表达质粒同时转染进细胞，质粒在细胞内同时表达不同的酶与蛋白的融合蛋白，不同的酶反应体系可以先后催化不同的DAB-金属聚合，在细胞内生物分子处原位产生DAB-金属聚合物。使用同步X射线成像观察，每种DAB-金属聚合物在X射线下具有特异性的荧光峰，从而实现对细胞内多种生物分子的特征识别和定位。