[发明专利]一种基于同步光源的X-射线多色遗传标记探针及其制备方法以及应用

权利要求书

1.一种基于同步光源的X-射线多色遗传标记探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

1）构建至少两种同时包括酶和目的蛋白的融合表达质粒，并将所述至少两种融合表达质粒同时转染进细胞，所述细胞表达至少两种不同的融合蛋白；

2）使用戊二醛固定液冰浴固定所述细胞；

3）加入针对第一种融合蛋白的第一DAB-金属络合物，冰浴反应，使所述第一种融合蛋白催化第一DAB-金属络合物发生聚合生成第一DAB-金属聚合物；

4）去除反应液，加入封闭液；

5）加入针对第二种融合蛋白的第二DAB-金属络合物，冰浴反应，使所述第二种融合蛋白催化第二DAB-金属络合物发生聚合生成第二DAB-金属聚合物；

6）若构建三种及三种以上同时包括酶和目的蛋白的融合表达质粒，则重复上述步骤4），5），直至所有融合蛋白催化相应的DAB-金属络合物发生聚合；

7）去除反应液，使用固定液固定细胞；以及

8）将步骤7）中的细胞滴加在同步成像基底上，同步X射线成像观察，每种DAB-金属聚合物在X射线下具有特异性的荧光峰，即得一种基于同步光源的X-射线多色遗传标记探针；

其中，步骤1）中，所述酶包括：抗坏血酸过氧化物酶、迷你单线态氧产生蛋白、四半胱氨酸肽以及辣根过氧化物酶；在步骤3）、5）中，所述DAB-金属络合物中的金属选自：Fe、Co、Ni、Cu、Zn、La、Sn、Cd组成的组中的任意一种，针对不同的融合蛋白选择不同种类的DAB-金属络合物；步骤3）、5）中，不同的酶反应体系的发生需要不同的反应条件：抗坏血酸过氧化物酶反应体系的发生需要H₂O₂；迷你单线态氧产生蛋白反应体系的发生需要持续的充O₂以及488nm光照；四半胱氨酸肽反应体系的发生需要加入ReAsH-EDT₂，持续的充O₂以及585 nm光照，通过控制反应条件的不同控制酶反应体系发生的先后顺序。

2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述戊二醛固定液的浓度为1.5～3％，固定时间为20～60 min。

3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤7）中，所使用的固定液包括：多聚甲醛、戊二醛、乙醇、甲醇、冰醋酸、丙酮或福尔马林，固定时间为10 min～2 h。

4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤8）中，根据不同的金属离子选择不同的入射能量，适用于Fe的入射能量为280-1500eV和7112-15000 eV、适用于Co的入射能量为280-1700eV和7709-16000 eV、适用于Ni的入射能量为280-1900eV和8332-17000 eV、适用于Cu的入射能量为280-2000eV和8979-18000 eV、适用于Zn的入射能量为280-2100eV和9659-20000 eV、适用于La的入射能量为280-2500eV、5483-12000 eV和38925-78000 eV、适用于Sn的入射能量为280-2000eV、3929-11000 eV和29200-50000 eV、适用于Cd的入射能量为280-1700eV、3538-11000 eV和26711-50000 eV。

5.一种根据权利要求1-4中任意一项所述的制备方法制得的基于同步光源的X-射线多色遗传标记探针。

6.一种根据权利要求5所述的同步X射线多色遗传标记探针在细胞内生物分子识别和成像中的应用，其特征在于，包括：构建同时包括酶和目的蛋白的多种融合表达质粒，并将所述融合表达质粒同时转染进细胞，质粒在细胞内同时表达不同的酶与蛋白的融合蛋白，不同的酶反应体系可以先后催化不同的DAB-金属络合物聚合，在细胞内生物分子处原位产生DAB-金属聚合物，使用同步X射线成像观察，每种DAB-金属聚合物在X射线下具有特异性的荧光峰，从而实现对细胞内多种生物分子的特征识别和定位。