[发明专利]一种用于治疗胸腔积液载药囊泡的制备方法

权利要求书

1.一种用于治疗胸腔积液载药囊泡的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、向50～100mL胸腔积液中加入8～10IU/mL肝素，在800～1000rpm离心5～10min，弃上清，将沉淀加入盛有20～30mL RPMI1640与聚蔗糖(1:1，V/V)混合溶液中，混合均匀后，在1500～2000rpm离心10～20min，吸取白膜状细胞层，放入RPMI1640培养基，在36～38℃、4～6％CO₂培养箱内培养2～4h后，收集悬浮细胞并接种于另一组RPMI1640培养基中，在36～38℃、4～6％CO₂培养箱内培养18～20h，进行贴壁培养，得到贴壁肿瘤细胞；

S2、无菌条件下，挑取S1中的贴壁肿瘤细胞，放入RPMI1640培养基中，在36～38℃、4～6％CO₂培养箱内，进行扩大培养，所得肿瘤细胞与培养液合称为肿瘤细胞液；

S3、无菌条件下，将S2的肿瘤细胞液置于紫外线照射36～42h后，对肿瘤细胞液超声破碎20～30min，再对超声破碎后的溶液进行梯度离心，得到肿瘤囊泡溶液；

S4、无菌条件下，按体积比1～2:5，将化疗制剂溶液与S3中肿瘤囊泡溶液在20～25℃，孵育1～3h，得到混合液；

S5、无菌条件下，以2～6℃、15000～20000rpm对混合液离心50～70min，弃上清，所得沉淀即为包含化疗制剂的囊泡；

S6、向S5中的包含化疗制剂的囊泡中加入体积比1:10～12的生理盐水，所得溶液即为载药囊泡溶液。

2.根据权利要求1所述的一种用于治疗胸腔积液载药囊泡的制备方法，其特征在于：所述S1与S2中的RPMI1640均选用含有8～12％胎牛血清的RPMI1640。

3.根据权利要求1所述的一种用于治疗胸腔积液载药囊泡的制备方法，其特征在于：所述S2中扩大培养后的细胞量为1.5×10⁷～2.0×10⁷。

4.根据权利要求1所述的一种用于治疗胸腔积液载药囊泡的制备方法，其特征在于：所述S3中超声破碎温度设置为2～6℃。

5.根据权利要求1所述的一种用于治疗胸腔积液载药囊泡的制备方法，其特征在于：所述S3中梯度离心操作步骤如下：

A、在2～6℃下，先以1000～2000rpm对紫外线照射后的肿瘤细胞液离心5～10min，弃沉淀，再以5000～8000rpm对上一组离心后的上清液离心离心5～10min，弃沉淀，上清液液即为初步囊泡液；

B、在2～6℃、15000～20000rpm对初步囊泡液离心50～70min，弃上清，沉淀即为肿瘤囊泡；

C、将肿瘤囊泡溶液置于10～20mL PBS溶液中进行重悬，震荡混合均匀后，所得即为肿瘤囊泡溶液。

6.根据权利要求5所述的一种用于治疗胸腔积液载药囊泡的制备方法，其特征在于：所述PBS溶液的pH选用7.2～7.4。

7.根据权利要求1所述的一种用于治疗胸腔积液载药囊泡的制备方法，其特征在于：所述S4中的化疗制剂选用足叶乙甙、5-氟脲嘧啶或卡铂(CBP)中的一种。

8.根据权利要求1所述的一种用于治疗胸腔积液载药囊泡的制备方法，其特征在于：所述S6中生理盐水的浓度选用0.8～1.0％。