[发明专利]全长启动子质粒PGL3-TREM-1的构建方法、其调控方法及其转录因子的筛选方法

说明书

本发明提供全长启动子质粒PGL3‑TREM‑1的构建方法，包括以下过程：收集小鼠肝脏组织，抽提小鼠肝脏组织的DNA，并以所抽取的DNA为模板及根据TREM‑1启动子特异性引物进行PCR，获得的PCR产物连接至PGL3‑Basic载体，连接产物转化至DH5α感受态细胞，获得的阳性克隆进行酶切、PCR及测序鉴定，对所构建的PGL3‑TREM‑1进行活性鉴定，PGL3‑TREM‑1构建成功。本发明还提供全长启动子质粒PGL3‑TREM‑1的调控方法，根据调控需求选择以后抑制方法或增强方法；本发明的实施例另外还提供全长启动子质粒PGL3‑TREM‑1的转录因子的筛选方法。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及全长启动子质粒PGL3-TREM-1的构建方法、其调控方法及其转录因子的筛选方法。

背景技术

巨噬细胞极化过程涉及多种细胞因子和受体，其中髓系细胞触发受体（triggering receptor expressed on myeloid cells, TREM）是近年来引起人们关注的一类分子。TREMs是一类隶属于免疫球蛋白超家族的细胞表面受体，主要包括TREM-1和TREM-2等，在炎症和免疫调节中发挥重要作用。研究表明，TREM-1信号通路的激活能够促进单核细胞分泌TNF-α、IL-8等促炎因子，在炎症反应的触发和放大过程中起着重要作用。同时，TREM-1介导的信号转导都能够促进巨噬细胞向M1极化，也就是说TREM-1具有使巨噬细胞从M2型向M1型极化的能力。血吸虫病肝纤维化发展过程中，巨噬细胞从M1逐渐向M2期转化，研究表明，曼氏血吸虫感染进程中脾脏巨噬细胞TREM-1表达持续增加，感染后第5周达到高峰，其后逐步下降。TREM-1在血吸虫病肝纤维化进程中的表达变化机制，未见报道；血吸虫病主要表现为以虫卵为中心的炎性肉芽肿形成以及肝纤维化形成，研究表明血吸虫肝纤维化的发生和发展与血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）密切相关，SEA 作为一种混合蛋白，其组分蛋白尤其P40 蛋白对肝脏巨噬细胞的调控机制的研究尤为重要，而其重组蛋白rSjP40对巨噬细胞中TREM-1表达的调控机制，也尚未见报道。

发明内容

本发明提供全长启动子质粒PGL3-TREM-1的构建方法、其调控方法及其转录因子的筛选方法。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供全长启动子质粒PGL3-TREM-1的构建方法，其特征在于，包括以下过程：收集小鼠肝脏组织，抽提小鼠肝脏组织的DNA，并以所抽取的DNA为模板及根据序列号：ENSMUSG00000042265的序列所设计的TREM-1启动子特异性引物进行PCR，获得的PCR产物连接至PGL3-Basic载体，连接产物转化至DH5α感受态细胞，获得的阳性克隆进行酶切、PCR及测序鉴定，对所构建的PGL3-TREM-1进行活性鉴定，PGL3-TREM-1构建成功。

进一步的，所述全长启动子质粒PGL3-TREM-1的活性鉴定包括以下过程：将PGL3-TREM-1质粒转染至RAW264.7细胞，荧光素酶活性检测试剂盒检测PGL3-TREM-1启动子活性。

本发明的实施例另外提供全长启动子质粒PGL3-TREM-1的调控方法，其特征在于，根据调控需求选择抑制方法或增强方法，具体包括，a. 抑制方法：将PGL3-TREM-1质粒转染至RAW264.7细胞，并经rSjP40处理，荧光素酶活性检测试剂盒检测PGL3-TREM-1启动子活性，PGL3-TREM-1启动子活性降低；b. 增强方法：将PGL3-TREM-1质粒转染至RAW264.7细胞，经作为作为阳参的LPS刺激后，荧光素酶活性检测试剂盒检测PGL3-TREM-1启动子活性，PGL3-TREM-1启动子活性增强。

本发明的实施例另外还提供全长启动子质粒PGL3-TREM-1的转录因子的筛选方法，其特征在于，包括以下过程：

（1）根据生物信息学分析显示PGL3-TREM-1质粒所包含的启动子区域上，存在转录因子FOXO3a结合位点；