[发明专利]一种脂肪源干细胞提取制备方法在审
| 申请号： | 201911082200.5 | 申请日： | 2019-11-07 |
| 公开（公告）号： | CN110628713A | 公开（公告）日： | 2019-12-31 |
| 发明（设计）人： | 张鹏成 | 申请（专利权）人： | 安徽科门生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/0775 | 分类号： | C12N5/0775 |
| 代理公司： | 11357 北京同辉知识产权代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 王依 |
| 地址： | 230000 安徽省合肥市高新区潜水*** | 国省代码： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 制备 生理盐水 脂肪组织 脂肪源干细胞 细胞 定向培养 人体环境 温度环境 细菌污染 孵育 附着 剪碎 酶解 取样 冲洗 培育 浸泡 细菌 模仿 消毒 并用 检测 | ||
1.一种脂肪源干细胞提取制备方法，制备流程包括：取样、剪碎、消毒冲洗、酶解、分离、孵育、检测和定向培养，其特征在于，具体提取制备方法如下：
S1、取样：用无菌针管从臀上方吸取深层脂肪组织；
S2、剪碎：将吸取到的深层脂肪组织剪碎；
S3、消毒冲洗：将深层脂肪组织碎块用PBS冲洗，用酒精棉擦拭干净，再用生理盐水浸泡；
S4、酶解：向消毒冲洗后的深层脂肪组织碎块中加入I型胶原酶和EDTA的混合液，并在37℃水浴中充分振荡；
S5、分离：向酶解后的深层脂肪组织碎块中加入适量PBS混合过滤后，再低速离心；
S6、孵育：在温度为37℃、含有CO2的培养箱中培育，48小时后首次换液，弃去悬浮细胞，随后每3天换液一次，传代后，此时细胞从组织块中生长为原代细胞；
S7、检测：将传代两次的第3代细胞用流式细胞仪进行检测，观察细胞是否浓集到128个/升；
S8、定向培养：当细胞浓集到128个/升时，转入培养基中定向培养2周，得到脂肪源干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种脂肪源干细胞提取制备方法，其特征在于，
S1、取样：用无菌针管从臀上方吸取深层脂肪组织10ml；
S2、剪碎：将吸取到的深层脂肪组织剪至大小为2mm的碎块；
S3、消毒冲洗：将深层脂肪组织碎块用PBS冲洗5次，用酒精棉擦拭干净，再用生理盐水浸泡2分钟；
S4、酶解：向消毒冲洗后的深层脂肪组织碎块中加入10ml体积比为1:3的I型胶原酶和EDTA的混合液，并在37℃水浴中充分振荡30分钟；
S5、分离：向酶解后的深层脂肪组织碎块中加入适量PBS混合过滤后，再低速离心10分钟，控制离心转速为800r/min；
S6、孵育：在温度为37℃、体积浓度为5％的CO2的培养箱中培育，48小时后首次换液，弃去悬浮细胞，随后每3天换液一次，7天后传代，此时细胞从组织块中生长为原代细胞；
S7、检测：将传代两次的第3代细胞用流式细胞仪进行检测，观察细胞是否浓集到128个/升；
S8、定向培养：当细胞浓集到128个/升时，转入培养基中定向培养2周，得到脂肪源干细胞。
3.根据权利要求1所述的一种脂肪源干细胞提取制备方法，其特征在于，
S1、取样：用无菌针管从臀上方吸取深层脂肪组织10ml；
S2、剪碎：将吸取到的深层脂肪组织剪至大小为2mm的碎块；
S3、消毒冲洗：将深层脂肪组织碎块用PBS冲洗5次，用酒精棉擦拭干净，再用生理盐水浸泡2分钟；
S4、酶解：向消毒冲洗后的深层脂肪组织碎块中加入20ml体积比为1:2的I型胶原酶和EDTA的混合液，并在37℃水浴中充分振荡30分钟；
S5、分离：向酶解后的深层脂肪组织碎块中加入适量PBS混合过滤后，再低速离心10分钟，控制离心转速为800r/min；
S6、孵育：在温度为37℃、体积浓度为5％的CO2的培养箱中培育，48小时后首次换液，弃去悬浮细胞，随后每3天换液一次，8天后传代，此时细胞从组织块中生长为原代细胞；
S7、检测：将传代两次的第3代细胞用流式细胞仪进行检测，观察细胞是否浓集到128个/升；
S8、定向培养：当细胞浓集到128个/升时，转入培养基中定向培养2周，得到脂肪源干细胞。
4.根据权利要求1所述的一种脂肪源干细胞提取制备方法，其特征在于，EDTA和I型胶原酶的混合液在转速500r/min的条件下搅拌5～10分钟，搅拌完成后保存在2～8℃的环境中。
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