[发明专利]ASFV-P54蛋白重组方法及利用其制备的夹心ELISA试剂盒

说明书

本发明涉及ASFV‑P54蛋白重组方法及利用其制备的夹心ELISA试剂盒，属于病毒检测领域，所述方法利用的PCR扩增引物，引物序列如SEQ NO.1和SEQ NO.2；这对引物只能扩增p54基因截短的CDS区片段，扩增目的基因长度为552bp。利用所述方法制备的蛋白p54制备的非洲猪瘟病毒夹心ELISA抗体检测试剂盒，包括含有以下组份，ASFV P54抗原包被板、ASFV阳性血清、ASFV阴性血清、20×洗涤液、酶标记的P54抗原、底物溶液A、底物溶液B和终止液。检测过程抗逆性强，检测时无需对血清样品进行稀释，检测时只需要直接加入待测血清样本50μL即可，大大节省了操作步骤。整个检测时间缩短为1个小时以内，提高了检测效率。

技术领域

本发明涉及一种ASFV-P54蛋白重组方法及利用其制备的夹心ELISA试剂盒，属于兽用生物制品领域。

技术背景

病原的抗体检测是评价动物是否感染某种病原行病学调查和监测的主要方式。酶联免疫吸附试验(ELISA)是酶免疫测定技术中应用最广的技术，其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表明，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的检测抗体的ELISA方法有间接ELISA法、竞争ELISA方法、阻断ELISA方法、夹心ELISA方法。其中，间接ELISA方法是将抗原包被在酶标上，分别加入待检血清和酶标记抗体，经底物显色，显色的强度与待测抗体的浓度呈正比，其优点是酶标抗体具有通用性，但缺点是本底过高，容易出现假阳性。竞争ELISA方法是将特异性抗体用酶标记后与待检抗体一起与包被抗原的酶标板进行反应，该方法的敏感性和专一性较低。阻断ELISA方法是先将待检血清与一定量抗原结合，占据抗原位点，然后再用已知量的阳性血清与抗原结合，最后通过检测抗原结合阳性血清的多少反推出待检血清中特异性抗体的数量，该方法操作繁琐、需要制备抗原、包被抗体、捕获抗体和酶标抗体，成本高。夹心ELISA又被称为双抗原夹心ELSIA，其原理是即先将抗原包被在酶标板上，然后加入待检血清抗体，再加入酶标记的抗原，形成“三明治”样的夹心检测模式，用于抗体的检测。在这几种ELISA方法中，夹心ELISA方法因其特异性好、成本底低而广受人们的喜爱，它既可以用于抗原的检测，也可以用于抗体的检测。尽管夹心ELISA使用方便，但对酶标记抗原的质量标准要求很高，一是这种抗原既能与过氧化物酶高效结合，二是酶标记后的抗原不影响抗原与抗体的结合活性。因此，鉴于上述几种ELISA方法的特点，目前用于抗体检测的方法主要是间接ELSIA方法和竞争ELISA方法，而夹心ELISA方法则由于开发难度大、技术要求高，很少有能在成功上市场销售的检测试剂盒及其产品。