[发明专利]具有皮肤细胞年轻化功效的旁分泌因子包裹体制备方法

说明书

本发明公开了具有皮肤细胞年轻化功效的旁分泌因子包裹体制备方法，包括以下步骤：步骤a：将脐带置于含储运液的储运瓶中，待分离制备；步骤b：将脐带置于培养皿中，用生理盐水充分洗涤脐带，将脐带两端各剪去1cm长，再反复洗涤脐带组织，直至无明显血块，将脐带剪成2cm长度的小段，清洗3次，将脐带纵向剖开，剔除血管，撕取华通氏胶，用生理盐水充分洗涤华通氏胶3次，后将其剪碎成1立方毫米～3立方毫米大小组织块。本发明通过将间充质干细胞旁分泌因子，用微囊包裹，可以常温保存，性质稳定，将此微囊包裹体与成纤维细胞共培养，能够提高成纤维细胞分泌胶原蛋白的增加，提高分裂活跃性，延长成纤维细胞的寿命。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为具有皮肤细胞年轻化功效的旁分泌因子包裹体制备方法。

背景技术

间充质干细胞是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞，MSC具有免疫调控、促进造血干细胞归巢、能够修复损伤或病变的组织器官、具备多向分化潜能等功能，因此具有广泛的应用前景。

随着对间充质干细胞研究的不断深入，其作用机理也越来越清晰明确，主要有3方面：1、间充质干细胞旁分泌作用，2、间充质干细胞替代或修复死亡或受损的组织细胞，3、细胞直接接触，调控细胞，越来越多的研究表明，间充质干细胞旁分泌作用在其发挥治疗效果中起主要作用，脐带间充质干细胞在培养过程中可分泌多种细胞因子，如表皮生长因子，血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子，基质细胞衍生因子-1、肿瘤坏死因子，神经生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白介素6等，间充质干细胞所分泌的因子具有改善细胞生长微环境、调节机体免疫、促进血管再生、促进细胞增殖、抑制细胞凋亡等功能，对受损皮肤、敏感皮肤以及改建性皮肤具有良好的修复、护理作用，能促进胶原蛋白合成，延缓衰老等。

将细胞旁分泌因子提纯浓缩后添加到美容化妆品中，是化妆品行业发展的新趋势，细胞旁分泌因子化妆品尤为甚行，但市面上的细胞旁分泌因子化妆品一般采用干细胞培养上清液直接掺入化妆品基质的方式生产，细胞旁分泌因子含量低，均一性差，稳定性差，美容护肤抗衰效果一般。

现有技术是用普通培养瓶培养间充质干细胞，并收集合并多代细胞培养上清液，并对上清液进行过滤得到细胞旁分泌因子，该方法得到的间充质干细胞旁分泌因子含量低，且该方法需要收集多代细胞培养基，效率低，且多代收集的方法制备细胞旁分泌因子，产品均一性较难保证，此外，该方法制备所得细胞旁分泌因子为液态，常温下易降解，需低温保存，加大保存和运输难度。

发明内容

本发明的目的在于提供具有皮肤细胞年轻化功效的旁分泌因子包裹体制备方法，具备旁分泌因子包裹体便于使用的优点，解决了旁分泌因子使用不方便的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：具有皮肤细胞年轻化功效的旁分泌因子包裹体制备方法，包括以下步骤：

步骤a：将脐带置于含储运液的储运瓶中，待分离制备；

步骤b：将脐带置于培养皿中，用生理盐水充分洗涤脐带，将脐带两端各剪去1cm长，再反复洗涤脐带组织，直至无明显血块，将脐带剪成2cm长度的小段，清洗3次，将脐带纵向剖开，剔除血管，撕取华通氏胶，用生理盐水充分洗涤华通氏胶3次，后将其剪碎成1立方毫米～3立方毫米大小组织块，将组织块接种于培养瓶中，放置于37℃，5％的CO2的培养箱中贴壁2h，添加15ml无血清完全培养基，置于培养箱中培养，保持培养箱绝对静止，在显微镜下观察，可见组织块周围有成纤维状细胞爬出，12d细胞数量较多，去除组织块，用胰蛋白酶消化将贴壁细胞转移至新的培养瓶中培养后进行传代；

步骤c：对培养后的细胞进行检测，将检测合格的细胞按3~5×104/ml的终浓度转至细胞工厂，做好标记，置37℃、5％CO2的培养箱中进行扩增培养，当扩增培养的细胞长至细胞融合度70％-80％时，调整参数为37℃、5％CO2、5％O2继续培养，24h后调整参数为37℃、5％CO2、15％O2，48h后收集半量上清液，并向细胞工厂内补充等量新鲜无血清培养基，调整参数为37℃、5％CO2、5％O2继续培养，72h后收集细胞上清液；