[发明专利]具有皮肤细胞年轻化功效的旁分泌因子包裹体制备方法

权利要求书

1.具有皮肤细胞年轻化功效的旁分泌因子包裹体制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤a：将脐带置于含储运液的储运瓶中，待分离制备；

步骤b：将脐带置于培养皿中，用生理盐水充分洗涤脐带，将脐带两端各剪去1cm长，再反复洗涤脐带组织，直至无明显血块，将脐带剪成2cm长度的小段，清洗3次，将脐带纵向剖开，剔除血管，撕取华通氏胶，用生理盐水充分洗涤华通氏胶3次，后将其剪碎成1立方毫米～3立方毫米大小组织块，将组织块接种于培养瓶中，放置于37℃，5％的CO2的培养箱中贴壁2h，添加15ml无血清完全培养基，置于培养箱中培养，保持培养箱绝对静止，在显微镜下观察，可见组织块周围有成纤维状细胞爬出，12d细胞数量较多，去除组织块，用胰蛋白酶消化将贴壁细胞转移至新的培养瓶中培养后进行传代；

步骤c：对培养后的细胞进行检测，将检测合格的细胞按3~5×104/ml的终浓度转至细胞工厂，做好标记，置37℃、5％CO2的培养箱中进行扩增培养，当扩增培养的细胞长至细胞融合度70％-80％时，调整参数为37℃、5％CO2、5％O2继续培养，24h后调整参数为37℃、5％CO2、15％O2，48h后收集半量上清液，并向细胞工厂内补充等量新鲜无血清培养基，调整参数为37℃、5％CO2、5％O2继续培养，72h后收集细胞上清液；

步骤d：将收集的间充质干细胞培养上清液放入离心管中，4℃，4000g离心8min，取上清，去除细胞沉渣，将上清液通过中空纤维滤膜过滤，收集滤液，将去沉渣后的滤液用移液管转移至5KD超滤浓缩离心管中，4℃，4000g离心1.5-2h，收集浓缩后的液体至新的离心管中，4°冰箱储存，将初步浓缩后的所有提取液转移至超滤管中，进一步浓缩1.5-2h，弃掉超滤管下面的液体，加盐水重复超滤离心洗涤一次，收集浓缩液得脐带间充质干细胞旁分泌因子浓缩原液，通过微囊包裹，得到微囊包裹体；

步骤e：将微囊包裹体用培养箱中含有成纤维细胞的培养基重悬、接种于培养瓶，在显微镜下观察，可见成纤维细胞分泌胶原蛋白增加，分裂活跃，寿命延长。

2.根据权利要求1所述的具有皮肤细胞年轻化功效的旁分泌因子包裹体制备方法，其特征在于：所述步骤a中储运液为40ml的α-MEM，并添加了庆大霉素100U/ml，青霉素50mg/ml，两性霉素B5ug/ml。

3.根据权利要求1所述的具有皮肤细胞年轻化功效的旁分泌因子包裹体制备方法，其特征在于：所述步骤b中无血清完全培养基为：体积浓度为2％血清替代物和体积浓度为1％谷丙氨酸二肽，其余为LONZA无血清培养基。

4.根据权利要求1所述的具有皮肤细胞年轻化功效的旁分泌因子包裹体制备方法，其特征在于：所述步骤a中取健康足月的新生儿脐带，且脐带靠近婴儿端20cm。